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大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞電生理特征的影響

來(lái)源：泰然健康網(wǎng) 時(shí)間：2024年12月22日 21:40

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞電生理特征的影響

【摘要】： 目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心臟疾病可以提高心臟功能，改善心室重構(gòu)，但干細(xì)胞對(duì)心臟電重構(gòu)有何作用，尤其對(duì)病理狀態(tài)下的心肌細(xì)胞電生理特征有何影響，目前研究不多。本研究利用體外培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞，并誘導(dǎo)為病理細(xì)胞模型，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后，通過(guò)檢測(cè)心肌細(xì)胞電生理特征變化，來(lái)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心臟電重構(gòu)是否有改善作用。方法：1.分離SD乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)，并檢測(cè)其電生理特征。2.分離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)傳代至第三代。3.將SD乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10-7mol/l血管緊張素Ⅱ培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)其為肥大心肌細(xì)胞，并通過(guò)BCA法測(cè)定心肌細(xì)胞總蛋白濃度及測(cè)量心肌細(xì)胞膜電容來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞已誘導(dǎo)為肥大心肌細(xì)胞。4.將SD乳鼠心肌細(xì)胞放入低氧培養(yǎng)箱（內(nèi)含5%CO2，94%N2，1%O2混合氣體）培養(yǎng)24h，取出后加入提前30分鐘通入氧氣飽和的含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，放入常規(guī)CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)為缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞，并通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中LDH活力來(lái)反映心肌細(xì)胞缺氧損傷的程度。5.利用Transwell培養(yǎng)板將SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與正常心肌細(xì)胞、肥大心肌細(xì)胞及缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)，對(duì)照組為人胚腎293細(xì)胞（HEK-293）與各組心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，心肌細(xì)胞在下層，干細(xì)胞或HEK-293在上層，接種比例為10:1，共培養(yǎng)72h。6.應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄正常心肌細(xì)胞、肥大心肌細(xì)胞、缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞及與干細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞共培養(yǎng)的各組心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位（AP）及瞬時(shí)外向鉀電流（ITO），測(cè)量動(dòng)作電位時(shí)程恢復(fù)至90%的時(shí)間（APD90），繪制瞬時(shí)外向鉀通道的電流-電壓曲線（I-V曲線）。7.提取心肌細(xì)胞總蛋白，采用Western Blot方法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀通道Kv4.2膜蛋白表達(dá)量的影響。8.提取心肌細(xì)胞mRNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀通道Kv4.2mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果：1. SD乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入濃度為10-7mol/l血管緊張素Ⅱ培養(yǎng)24h可成功誘導(dǎo)為肥大心肌細(xì)胞。肥大心肌細(xì)胞總蛋白濃度高于空白對(duì)照組（分別為128.4±17.6mg/well，n=6；103.4±8.9mg/well，n=8；p＜0.05)。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定肥大心肌細(xì)胞膜電容大于對(duì)照組（分別為36.39±16.13pF（n=28）；26.14±7.83pF（n=35），p＜0.05）2. SD乳鼠心肌細(xì)胞放入低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，后加入復(fù)氧培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)可誘導(dǎo)為缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞，測(cè)定缺氧24h的細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活力較對(duì)照組明顯升高（分別為547.20±42.12（n=9）；287.45±26.10（n=12）p＜0.05）。3.應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，測(cè)定各組心肌細(xì)胞的APD90，正常心肌細(xì)胞APD90為124.52±15.56ms，n=16；BMSCs與正常心肌細(xì)胞共培養(yǎng)APD90為102.15±11.37ms，n=9；HEK-293與正常心肌細(xì)胞共培養(yǎng)APD90為126.31±11.04ms，n=8；肥大心肌細(xì)胞APD90為265.74±65.88ms，n=15；BMSCs與肥大心肌細(xì)胞共培養(yǎng)APD90為182.63±29.12ms，n=13；HEK-293與肥大心肌細(xì)胞共培養(yǎng)APD90為254.53±59.12ms，n=7；缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞APD90為201.74±35.88ms，n=12；BMSCs與缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞共培養(yǎng)APD90為168.03±24.12ms，n=10；HEK-293與缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞共培養(yǎng)APD90為212.17±19.06ms，n=8。BMSCs可縮短正常心肌細(xì)胞、肥大心肌細(xì)胞及缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位時(shí)程（p＜0.05）。HEK-293細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程無(wú)影響（p＞0.05）。4.瞬時(shí)外向鉀電流（ITO）：BMSCs與正常心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組的ITO通道的平均電流密度值高于正常心肌細(xì)胞組和HEK-293共培養(yǎng)組（p＜0.05）；BMSCs與肥大心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組的ITO通道的平均電流密度值高于肥大心肌細(xì)胞組和HEK-293共培養(yǎng)組（p＜0.05）；BMSCs與缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞共培養(yǎng)組的ITO通道的平均電流密度值與缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞組和HEK-293共培養(yǎng)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。5. Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，BMSCs可上調(diào)正常心肌細(xì)胞、肥大心肌細(xì)胞膜表面瞬時(shí)外向鉀離子通道Kv4.2蛋白的表達(dá)量（p＜0.05），對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。6.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，BMSCs可上調(diào)正常心肌細(xì)胞、肥大心肌細(xì)胞Kv4.2mRNA的表達(dá)量（p＜0.05），對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。結(jié)論：1.肥大心肌細(xì)胞及缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞的瞬時(shí)外向鉀離子通道電流密度降低，動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以上調(diào)正常心肌細(xì)胞和肥大心肌細(xì)胞的瞬時(shí)外向鉀電流、縮短動(dòng)作電位時(shí)程，縮短缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌細(xì)胞電重構(gòu)有改善作用。3.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可上調(diào)正常心肌細(xì)胞與肥大心肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀離子通道Kv4.2膜蛋白及Kv4.2mRNA的表達(dá)量，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞的Kv4.2膜蛋白及Kv4.2mRNA表達(dá)量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013