中國白酒歷史悠久，以糧谷類為主要原料，以大曲、小曲或者麩曲為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)、半固態(tài)或者液態(tài)的發(fā)酵方式，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、老陳、勾調(diào)等過程制成。中國白酒由于其生產(chǎn)所在的自然環(huán)境差異、釀造原料差異、糖化發(fā)酵劑差異、生產(chǎn)工藝差異和餾酒差異，風格各具特色。
隨著“健康中國”戰(zhàn)略的制定與實施，消費者對于白酒健康層面的需求也愈加明顯。食品安全與飲食健康成為熱議話題，健康飲酒被提升至新的高度。據(jù)統(tǒng)計，2015-2022年白酒消費趨勢向名優(yōu)產(chǎn)品轉(zhuǎn)變，白酒產(chǎn)業(yè)正在向高質(zhì)量發(fā)展穩(wěn)步推進，研究內(nèi)容也向白酒健康價值等方向傾斜。
已知白酒中的功能因子包含酸類、醇類、酚類、酯類、醛酮類、活性肽、氨基酸、多糖和吡嗪類等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降脂、降血壓、鎮(zhèn)痛、抑菌、降血糖，預防心腦血管疾病、精神系統(tǒng)疾病等功效，如亞麻酸、γ-氨基丁酸、洛伐他汀等成分早已在行業(yè)開展研究。
四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TTMP)又名川芎嗪，易溶于醇，微溶于水，近年來受到行業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注。其對白酒醬香風味的形成有重要貢獻，同時也是行業(yè)公認的“健康因子”，具有擴張血管、輕度降壓、防止血小板凝集與血栓形成、抑制纖維細胞增生、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、提升免疫水平、利尿、護肝、體外抗炎等諸多功效。本文綜述了TTMP在白酒中的研究進展，旨在為后續(xù)學者進一步研究提供參考。
TTMP在白酒中的研究進展
早在20世紀80年代，在白酒風味物質(zhì)解析時發(fā)現(xiàn)了TTMP的存在，2005年，莊名揚提出通過美拉德反應(yīng)生成吡嗪等雜環(huán)化合物有助于白酒風味的形成，2006年吳建峰提出TTMP是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在，引起行業(yè)關(guān)注，2012年徐巖團隊依托“中國白酒169計劃”分析檢測到茅臺酒中有重要風味貢獻度的物質(zhì)中TTMP等吡嗪類化合物有較高濃度，為白酒“健康因子”概念的引入奠定基礎(chǔ)。
隨著人們對健康關(guān)注度的提高和日常檢驗分析技術(shù)的提升，近年來TTMP在白酒領(lǐng)域的研究熱度逐漸升溫，熱點集中于探究新釀酒xinniangjiu微信平臺原載白酒發(fā)酵過程中TTMP的生成方式和重要積累環(huán)節(jié)，高產(chǎn)TTMP功能菌株的分離、篩選及強化應(yīng)用，利用多種檢測手段對白酒生產(chǎn)過程與成品酒中的TTMP進行定性與定量分析等。
1.1 白酒釀造過程中TTMP的生成和積累
1.1.1TTMP的生成方式
早期學者對于TTMP在白酒發(fā)酵過程中的生成方式普遍認為有兩種路徑：葡萄糖和氨基酸在高溫作用下通過美拉德反應(yīng)生成；微生物引發(fā)糖降解產(chǎn)生丙酮酸，兩分子的丙酮酸縮合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脫羧產(chǎn)生乙偶姻，發(fā)酵體系中的乙偶姻和氨基酸在相關(guān)酶的催化作用下生成TTMP。隨著研究的深入，通過第二種路徑生成TTMP的結(jié)論被不斷證實。
吳建峰于2013年發(fā)現(xiàn)并證明在固態(tài)發(fā)酵條件下，功能菌株枯草芽孢桿菌S12代謝產(chǎn)生3-羥基丁酮（又名：乙偶姻），同時S12分泌蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，氨基酸脫氫得到氨，3-羥基丁酮和氨通過縮合作用合成TTMP，且高溫有利于此縮合反應(yīng)的發(fā)生。
張溫清基于功能菌株強化接種與TTMP產(chǎn)生情況，證實糟醅中TTMP含量與溫度和功能菌株豐度呈正相關(guān)，釀酒過程中TTMP是由釀造微生物通過生物途徑代謝產(chǎn)生，并且高溫對其形成有促進作用，進一步證實固態(tài)發(fā)酵條件下的TTMP生成方式并非傳統(tǒng)認為的美拉德反應(yīng)，而是生物反應(yīng)。
侯孝元總結(jié)了前人對于TTMP的合成路徑研究經(jīng)驗，總結(jié)出提高微生物發(fā)酵生成TTMP的兩種方法：一是獲得優(yōu)良菌株，提高前體乙偶姻的積累量；二是向發(fā)酵液中添加銨鹽提高乙偶姻轉(zhuǎn)化率和四甲基吡嗪的產(chǎn)率。
綜上所述，TTMP的生物代謝途徑為通過性能優(yōu)良菌株獲得TTMP的前體物質(zhì)3-羥基丁酮，3-羥基丁酮與氨在高溫作用下發(fā)生縮合反應(yīng)生成TTMP，氨的來源包括外部環(huán)境添加、底物中蛋白質(zhì)降解脫氫等。
1.1.2TTMP的重要產(chǎn)生環(huán)節(jié)
白酒釀造過程涉及制曲、發(fā)酵、蒸餾等多個環(huán)節(jié)，不同企業(yè)在發(fā)展過程中摸索形成了自身獨具特色的釀造工藝，加之地域差異導致的菌群差異，從而形成國內(nèi)十二大白酒香型?；谀壳暗难芯繄蟮溃u香型和芝麻香型白酒中吡嗪類物質(zhì)的含量相較于其他香型白酒是最高的，與其生產(chǎn)工藝密切相關(guān)。醬香型白酒和芝麻香型白酒釀造工藝都具有高氮原料、高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵以及高溫餾酒的特點。這與上述吳建峰與張溫清提出的高溫對TTMP形成有促進作用的結(jié)論相印證。同時二位學者新釀酒xinniangjiu微信平臺原載以芝麻香型白酒酒曲、酒醅和基酒等為研究對象，對TTMP的積累環(huán)節(jié)進一步驗證，得到多糧曲高于小麥純糧曲，高溫曲（頂溫近67℃）高于中溫曲（頂溫50～55℃），細菌曲高于真菌曲的結(jié)論，吡嗪類物質(zhì)在堆積后含量增加，高溫發(fā)酵和高溫蒸餾也有利于TTMP形成，原酒儲存中不產(chǎn)生TTMP。
圖1.基于酶與熱力學耦連的TTMP合成路徑圖
相較小麥純糧曲，多糧曲中增加了高含蛋白的豌豆、大麥等原料，為TTMP的形成提供了更多必要的氮類前體物質(zhì)。高產(chǎn)TTMP前體物質(zhì)3-羥基丁酮的優(yōu)良菌株主要為細菌而非真菌，高溫是縮合反應(yīng)生成TTMP的必要條件。TTMP在釀酒過程中的重要產(chǎn)生環(huán)節(jié)包括高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵等。
1.2 TTMP功能菌株分離、篩選及強化應(yīng)用
1.2.1功能菌株的分離與篩選
與上述TTMP的主要產(chǎn)生環(huán)節(jié)相關(guān)聯(lián)，野生型功能菌株的主要來源為高溫大曲和高溫堆積料等，已報道的功能菌株主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillus），包括枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）等，也與上述細菌曲高于真菌曲的實驗結(jié)論相印證。功能菌株的分離多依賴傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，以基于感官評價的產(chǎn)醬香能力或基于生化反應(yīng)（V-P實驗）的產(chǎn)乙偶姻（TTMP前體物質(zhì)）能力作為篩選指標，也有學者將產(chǎn)蛋白酶能力與產(chǎn)乙偶姻能力作為雙篩指標，以獲得功能菌株。V-P實驗基本原理為乙偶姻在強堿環(huán)境下，氧化為雙乙酰，雙乙酰與胍基反應(yīng)生成紅色化合物，甲萘酚的存在可以促進并加速紅色物質(zhì)生成，于500～600nm范圍內(nèi)有光吸收，吸光度在一定范圍內(nèi)與乙偶姻濃度呈正相關(guān)，基于此原理，學者們開發(fā)了平板篩選、高通量篩選等方法。
野生型菌株生產(chǎn)TTMP產(chǎn)量低的問題普遍存在，學者們采用誘變育種、基因工程等手段對產(chǎn)TTMP菌株進行改造與調(diào)控，以期獲得高產(chǎn)菌株。許平等采用亞甲基胍誘變方式對出發(fā)菌株做誘變篩選，以期提高誘變菌株產(chǎn)TTMP能力；郭維偉對從景芝芝麻香白酒高溫大曲中分離的野生地衣芽孢桿菌進行等離子誘變，篩選獲得高產(chǎn)突變株，發(fā)酵液產(chǎn)量達到20.24g/L，比原始菌株提高了72.67%，遺傳性狀穩(wěn)定；黃曉潤對枯草芽孢桿菌產(chǎn)醬香相關(guān)基因進行篩選與功能研究，鎖定得出3個產(chǎn)醬香候選基因cdoA（半胱氨酸雙加氧酶）、panE（酮泛解酸還原酶）、lspA（脂蛋白信號肽酶Ⅱ），并證實3個基因最終作用于丙酮酸途徑，從而影響四甲基吡嗪合成；Wu等通過敲除枯草芽孢桿菌BS2中的bdhA（2,3-丁二醇脫氫酶）基因，增加乙偶姻的積累從而增加發(fā)酵終產(chǎn)物中的TTMP產(chǎn)量，為從基因?qū)用鎸崿F(xiàn)產(chǎn)物表達調(diào)控提出了研究思路。
圖2.V-P實驗反應(yīng)
1.2.2功能菌株的強化應(yīng)用
白酒釀造過程中功能菌株的強化應(yīng)用場景多發(fā)生于TTMP的主要產(chǎn)生環(huán)節(jié)，包括制曲、堆積和發(fā)酵等。
1.2.2.1強化制曲
強化制曲分為強化麩曲與強化大曲兩個工藝方向，強化麩曲的研究與應(yīng)用最為多見。強化麩曲的應(yīng)用場景之一是在傳統(tǒng)釀造工藝的基礎(chǔ)上，引入強化麩曲或改良麩曲以實現(xiàn)酒體風味的改變與提升，如張溫清對芝麻香麩曲原料配比、酸堿度、含水量和接種量等因素進行工藝優(yōu)化，獲得的功能麩曲中TTMP含量達607.58mg/kg，以丟糟作為功能麩曲原料之一進一步優(yōu)化制備工藝，TTMP產(chǎn)量達1.28×103mg/kg，為目前報道的最高水平；葛向陽等將接有功能菌株的大曲應(yīng)用到釀造環(huán)節(jié)以探索濃香型白酒高產(chǎn)TTMP的釀造工藝，結(jié)果表明，60%的功能曲與40%的大曲結(jié)合可以使?jié)庀阈驮芓TMP含量提高到3～6mg/L，是原始工藝的5～20倍；李曉霞從汾酒大曲中分離獲得高產(chǎn)TTMP菌株，制備成固態(tài)菌劑后，在不干擾正常的釀酒生產(chǎn)下，以1%添加量同大曲一并加至酒醅中，進行入缸發(fā)酵，結(jié)果表明TTMP含量增加到5.3μg/mL，為對照組的3倍。
1.2.2.2強化發(fā)酵
強化發(fā)酵包括強化堆積發(fā)酵與強化入池發(fā)酵兩個方向。王西等將從高溫大曲中篩選得到的枯草芽孢桿菌分別接種到醬香型二次酒高溫堆積前和入池前的糟醅中，模擬醬香型白酒生產(chǎn)完成堆積與入池發(fā)酵過程，“堆積組”發(fā)酵后的TTMP含量是“空白組”的3.08倍，“入池組”發(fā)酵后的TTMP含量是“空白組”的2倍。王曉丹等將從高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌添加到粹沙酒窖池中層的糟醅中，發(fā)酵后TTMP含量是對照組的3.03倍。
1.2.2.3多環(huán)節(jié)強化工藝結(jié)合
除上述單一強化手段外，學者們也將功能菌株強化應(yīng)用于白酒釀造的多個環(huán)節(jié)中，或在原有工藝基礎(chǔ)上改良多個環(huán)節(jié)。艾金鐘等在紅星二鍋頭原有工藝基礎(chǔ)上，增加高溫堆積環(huán)節(jié)，將蛋白酶活性較高的芽孢桿菌制備為功能麩曲，聯(lián)合高溫大曲共同用于堆積發(fā)酵，在原酒風格基本不變的情況下，TTMP含量由原工藝的0.03mg/L提高至約10mg/L；馬美榮等從北京紅星（清香型）大曲中分離獲得高產(chǎn)TTMP芽孢桿菌用于麩曲制作，結(jié)合高溫堆積發(fā)酵過程用于清香型白酒生產(chǎn)，原酒風格整體不變，TTMP含量由傳統(tǒng)工藝的0.11mg/L提升至10mg/L以上；盧君將功能菌株制備為固體菌劑，分別通過在入池發(fā)酵前進行強化接種、將菌劑加入尾酒中用于酒糟串蒸以及將上述兩種方法相結(jié)合的方式進行工藝優(yōu)化，醬香型白酒基酒中TTMP的含量分別提高160.71%、85.75%和202.75%。
盡管功能菌株的強化應(yīng)用研究如火如荼，但大家的關(guān)注點普遍在于基酒中四甲基吡嗪含量的變化，對于強化應(yīng)用后整體酒質(zhì)風味、風格的改變，發(fā)酵過程中強化菌株對于原始菌群的擾動情況并未做深入分析，行業(yè)也暫無實際強化應(yīng)用的案例，可見對于功能菌株的應(yīng)用仍需建立在對發(fā)酵機理研究更為透徹的基礎(chǔ)之上。
TTMP的檢測
2016年國家發(fā)布了GB1886.295-2016《食品添加劑2,3,5,6-四甲基吡嗪》，該方法適用于由2,3-丁二胺和丁二酮，或者由乙偶姻和銨鹽制備而得的食品添加劑TTMP，此國標方法的檢測對象為高純度TTMP。白酒在釀造過程中發(fā)酵底物復雜，狀態(tài)多樣，代謝化合物種類繁多，TTMP作為白酒中的微量組分，對檢測方法的適用性和準確度提出挑戰(zhàn)。目前，白酒中TTMP的分析步驟涉及萃取和檢測過程。
2.1 萃取方法
白酒過程樣品及成品酒樣中TTMP的常見萃取方法包括液液萃?。↙LE）、固相萃取（SPE）、液液微萃?。↙LME）、固相微萃?。⊿PME）和頂空固相微萃?。℉S-SPME）等，不同提取方法有各自的優(yōu)缺點。
在此基礎(chǔ)上學者們也對提取方法做了進一步優(yōu)化，如孫嘯濤等建立了渦旋輔助液液微萃取技術(shù)，使待測化合物在樣品溶液及萃取劑之間1min達到萃取平衡，具有高效、快速和低溶劑消耗的特點，實現(xiàn)了快速萃取技術(shù)的開發(fā)。
2.2 檢測方法
早期學者多使用液相色譜法（LC）和氣相色譜法（GC）完成白酒過程樣品及成品樣品中TTMP的檢測，上述檢測方法操作簡單，精密度較高，對白酒廠的儀器設(shè)備條件要求不高，便于推廣。隨著檢測技術(shù)的提升與各種高端質(zhì)譜的引進，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）在白酒行業(yè)興起，質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)極大提高了檢測準確度，降低了新釀酒xinniangjiu微信平臺原載目標物檢出的限量值。司冠儒等基于芝麻香型白酒樣品對氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的重復性和精確度進行評估，發(fā)現(xiàn)上述技術(shù)均可以滿足白酒廠日常檢測分析的要求?；谌粘z測經(jīng)驗，針對大曲、糟醅等TTMP含量較低的復雜基質(zhì)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢出限更低，靈敏度更高，為后續(xù)學者開展檢測工作提供參考。
表1.TTMP的常見萃取方法
黃杰等建立了白酒中TTMP的氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜（GC-QQQ）測定法，該法樣品預處理簡單，分離度高，測定低限0.2mg/L，為定量測定白酒中TTMP提供了一種有益探索；Zhu等使用全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）技術(shù)對茅臺中的重要風味物質(zhì)進行定性與定量識別，有效識別出含氮類物質(zhì)19種，包括TTMP；王柏文等應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）與氣相色譜-氮磷檢測器（GC-NPD）技術(shù)對國井芝麻香型白酒中含氮化合物進行分析，含氮化合物專用檢測器相較傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測器靈敏度更高，提高了白酒中含氮化合物檢測的精度。
結(jié) 論
隨著國民生活水平的顯著提高，我國已經(jīng)進入了消費者對美酒追求的時代，但白酒行業(yè)整體產(chǎn)能過剩，優(yōu)質(zhì)酒產(chǎn)能不足，成為優(yōu)質(zhì)白酒在消費市場供應(yīng)的關(guān)鍵矛盾點，因此白酒產(chǎn)品勢必要向“風味與品質(zhì)”雙導向轉(zhuǎn)變。
白酒中TTMP的相關(guān)研究已經(jīng)持續(xù)數(shù)十年，隨著健康因子概念的提出，更是成為行業(yè)研究熱點。但目前仍存在一些問題有待探討，如高產(chǎn)TTMP菌株的強化接種操作對整個白酒釀造體系中繁雜的菌系、酶系和物系存在更多積極或消極的影響還未知，功能菌劑的實際應(yīng)用仍屬于起步階段，TTMP在白酒領(lǐng)域的檢測方法仍沒有統(tǒng)一的標準等。
白酒中微量成分多種多樣，健康因子種類眾多，除文中提到的TTMP，還包括萜烯類、多元醇和生物活性肽等，對于白酒中功能成分的研究將有助于消費者正確認識白酒，樹立白酒正確的消費觀和價值觀，真正實現(xiàn)“少喝酒，喝好酒”，“理性飲酒，健康消費”。(完)
文|孫玉婷 鄭曉衛(wèi) 葉力
陳玉紅 楊鑫 劉沛通 丁子元返回搜狐，查看更多
