文｜廣發(fā)證券，孔令巖、羅佳榮

編輯｜BiG

穩(wěn)定性化學(xué)修飾與遞送系統(tǒng)是核酸藥物設(shè)計策略的關(guān)鍵。安全性與療效是 RNA 靶向藥物設(shè)計與開發(fā)所面臨的主要挑戰(zhàn)，也是早期藥物研發(fā)失敗的主要原因。

RNA 靶向藥物設(shè)計與開發(fā)的主要挑戰(zhàn)

基于早期RNA靶向藥物的臨床開發(fā)經(jīng)驗表明，避免藥物所帶來的細(xì)胞毒性是十分必要的，安全性問題是早期RNA靶向藥物研發(fā)失敗的主要原因。

RNA靶向療法開 發(fā)過程中的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)是避免非特異性毒性，細(xì)胞毒性主要有以下四個來源：

細(xì)胞內(nèi)先天感應(yīng)器對外來雙鏈RNA（dsRNA）的免疫原性反應(yīng)；遞送系統(tǒng)及輔料的免疫原性和非免疫原性毒性作用；由于藥物脫靶的而導(dǎo)致的非預(yù)期的生理活動；藥物在非靶組織中積累影響其在靶向組織的生理活性。    

免疫原性的毒性

對外源性dsRNA的先天免疫反應(yīng)來源于細(xì)胞內(nèi)PKr、toll樣受 體3（toll-like receptor 3，tLr3）和tLr7的感應(yīng)，伴隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在可以通過 廣泛的2’-MOE修飾在很大程度上避免了這個問題。

遞送系統(tǒng)及輔料的毒性

輔料中化學(xué)物質(zhì)的毒性作用已經(jīng)困擾了基于納米顆粒遞送系統(tǒng)的藥物開發(fā)，并且可能是導(dǎo)致許多相關(guān)候選藥物劑量限制毒性的主要原因， 臨床試驗表明觸發(fā)因素可能直接來自輔料成分或輔料代謝分解，后者會隨著時間的 推移而發(fā)生變化。此外，當(dāng)細(xì)胞毒性確實發(fā)生時，難以確定確切的毒性成分可能是另外一個主要的挑戰(zhàn)。目前，臨床中研究的關(guān)鍵策略可能是將輔料限制在少量的化學(xué)成分中，這些化學(xué)成分單獨驗證是低毒性的，組裝的納米顆粒需要盡可能均勻， 對改善藥物治療窗口和降低毒性有密切相關(guān)性。與此同時，納米顆粒制劑可能會隨 著時間的推移而降解，并導(dǎo)致毒性增加，對試驗藥物的持續(xù)質(zhì)量監(jiān)測很可能有利于未來的試驗。最后，使用糖皮質(zhì)激素和抗過敏藥物進(jìn)行預(yù)處理已經(jīng)大大減輕了基于納米顆粒遞送系統(tǒng)藥物的輸液反應(yīng)。

脫靶效應(yīng)的毒性

雖然ASO與siRNA藥物可以以特異性靶向靶基因，但非靶基 因的沉默也可能發(fā)生在藥物活性成分和非靶向mRNA之間的種子區(qū)匹配中。這一問題可以通過使用諸如Blast或者其他消除與靶基因有顯著重疊的靶點等工具來篩選針對人類基因組序列的靶點來改善。然而，確保安全性的唯一方法是通過廣泛的測試， 使用與人類有大量基因組序列重疊的靈長類模型是至關(guān)重要的。即使經(jīng)過廣泛的測試，一些脫靶效應(yīng)可能是不可避免的，臨床中的開發(fā)人員正試圖通過最小化藥物劑 量或使用新的堿基修改來避免這些問題。

非靶組織中累積的毒性

RNA靶向藥物被系統(tǒng)地輸送到體內(nèi)后，會在許多非藥物活性部位的組織中積累。如今，RNA靶向藥物開發(fā)者通過選擇具有高度疾病選擇性的基因作為沉默的靶標(biāo)，以及通過選擇減少非靶標(biāo)組織中積累的遞送系統(tǒng)和給藥 路徑緩解這些問題。未來對RNA靶向藥物的組織特異性靶向的改進(jìn)可能會緩解這些限制，促進(jìn)針對其他適應(yīng)癥開發(fā)的進(jìn)展。RNA靶向藥物研發(fā)的另一個主要挑戰(zhàn)是藥代動力學(xué)方面的難題，系統(tǒng)性給藥后首先在體循環(huán)中需要克服血清核糖核酸酶降解，使RNA藥物跨越目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜， 隨后完成內(nèi)體逃脫以保證足夠數(shù)量的RNA分子在進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮藥理作用，這對于 藥物的療效影響深遠(yuǎn)。伴隨著技術(shù)的發(fā)展，一方面一些化學(xué)修改可以極大地提高代謝穩(wěn)定性和PK屬性，從而使得藥物更為高效，目前FDA批準(zhǔn)的所有ASO藥物都進(jìn)行了大量的化學(xué)修飾，而這些藥物不需要額外的輔料，可以像小分子藥物一樣分配到 目標(biāo)細(xì)胞以達(dá)到療效；另一方面，RNA靶向藥物可以通過特定材料包封或偶聯(lián)配體 以及通過病毒載體等遞送系統(tǒng)進(jìn)行給藥，進(jìn)而提升藥物的靶向性與療效。此外，像所有其他類別的藥物一樣，RNA療法的靶向性和安全性是劑量依賴的。當(dāng)使用更高或更大劑量的RNA靶向藥物時，通常會觀察到劑量受限的脫靶效應(yīng)。因此，除了設(shè)計最佳序列和使用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)/自然修飾以避免或減少免疫原性和脫靶效應(yīng)外，確定正確的劑量以達(dá)到治療效果和安全性對RNA藥物的開發(fā)是至關(guān)重要的。  穩(wěn)定性化學(xué)修飾
  對于RNA靶向藥物而言，化學(xué)修飾（除了組織靶向配體）主要有兩個基本功能：首先，化學(xué)修飾可通過減弱細(xì)胞內(nèi)源性免疫傳感器對dsRNA的免疫反應(yīng)，大幅提高 藥物的安全性。其次，通過增強(qiáng)RNA藥物抵抗內(nèi)源性內(nèi)切酶和外切酶降解的能力， 大幅提升藥物療效。針對siRNA藥物，化學(xué)修飾還可以增強(qiáng)其反義鏈對RISC負(fù)載的選擇性，提高序列選擇性以降低脫靶RNAi活性，改變物理和化學(xué)性質(zhì)以增強(qiáng)遞送能 力。迄今為止，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的所有RNA靶向藥物都是化學(xué)工程的RNA類似物，支持了化學(xué)修飾的效用。針對特定化學(xué)修飾類別的單鏈寡核苷酸只是在序列上有所不同，但都具有相似 的物理化學(xué)特性，因此具有共同的藥代動力學(xué)和生物學(xué)特性。然而，每個化學(xué)類別都是不同的，即使2’-甲氧基乙基（2’-MOE）與2’-甲氧基（2’-OMe）之間的細(xì)微修 改，也可能導(dǎo)致藥效、藥代動力學(xué)的重大變化。因此，精確定義RNA靶向藥物的化 學(xué)性質(zhì)是非常必要的。具體化學(xué)修飾類型及其功效如下：

2’端核糖替代策略

寡核苷酸在核糖2’端的羥基（-OH）可以被MOE、OMe、F 等取代基替代，用于降低免疫原性、增加對核酸酶抗性、改善血漿的穩(wěn)定性，從而延長了藥物作用。（1）2’-甲氧基乙基（2’-MOE）：可以提高藥物PK，清除半衰期 延長至2-4周，提高與靶向mRNA的結(jié)合能力以及效力，降低細(xì)胞毒性；（2）2’-甲 氧基（2’-OMe）：可以提高藥物PK和穩(wěn)定性，適度的提高效力與降低免疫原性；（3） 2’-氟（2’-F）：可提高藥物與靶向mRNA的結(jié)合能力但不能提高穩(wěn)定性與PK，更適 用于RISC機(jī)制的siRNA藥物，其修飾的核苷酸代謝物存在整合宿主細(xì)胞DNA或RNA 的可能性，可導(dǎo)致部分核蛋白降解。
在實際應(yīng)用中，核糖2’端的修飾與RNase H活性不兼容，這意味著它們通常用于空間位阻型的ASO或用于Gapmer ASO的側(cè)翼序列（如Mipomersen、Inotersen 在側(cè)翼序列中引入了2’-MOE修飾）。此外，2’-MOE修飾通常不被納入siRNA設(shè)計中， Ago2的結(jié)構(gòu)要求限制了可以使用的化學(xué)修飾類型，2’-MOE被證明對RNase H活性 的ASO非常有用，但不支持與Ago2結(jié)合的siRNA。

5’端核酸堿基修飾策略

5’-Methylcytidine（甲基胞苷）與5’-Methyluridine（甲 基尿苷）修飾可以提高藥物與靶mRNA的結(jié)合能力，降低免疫原性，但僅用于雜環(huán)修飾。嘧啶甲基化可提高每一修飾的寡核苷酸熔解溫度約0.5℃，提高藥物與靶 mRNA的結(jié)合能力和穩(wěn)定性，通常被應(yīng)用于ASO藥物中（如Ionis制藥公司正在開發(fā)的ASO藥物均有所使用）。

核糖骨架修飾策略

寡核苷酸的磷酸二酯鍵可被硫代磷酸（PS）鍵所替代，即 核苷酸間磷酸基的一個非橋接氧原子被硫取代，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于RNA靶向藥物的開發(fā)。PS核糖骨架是一種非常有效的修飾，具有核酸酶抗性和促進(jìn)與血漿蛋白質(zhì)結(jié) 合的雙重作用，從而減少腎臟清除率，增加藥物的體內(nèi)循環(huán)時間、改善藥物的藥代 動力學(xué)，藥物的清除半衰期提升至1-3天。PS核糖骨架支持多種作用機(jī)制的RNA靶向藥物，尤其在Gapmer ASO和 GalNAc siRNAs應(yīng)用中效率較高。PS核糖骨架修飾在ASO設(shè)計中易于耐受，且不破 壞RNase H活性，大部分已經(jīng)上市的ASO藥物中均有使用，在系統(tǒng)性給藥后可被大 多數(shù)細(xì)胞吸收，不需要靶向配體。相比之下，在每個連鎖位點上都含有PS修飾的 siRNA活性低于等效磷酸二酯（PO）siRNA，因此如果含有PS修飾的siRNA通常只 在末端被修飾（如已獲批上市的Patisran）。
在RNA靶向藥物中增加使用PS修飾的一個缺點是，每個PS修飾都會引入一個 具有兩種可能手性取向的立體中心，因此具有n個PS修飾的寡核苷酸是2n個外消旋 體的混合物。這兩種取向具有明顯不同的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，雖然Sp取向的 PS鍵對核酸酶裂解有更好的抵抗能力，但與Rp取向相比，它們也傾向于減少對堿基 的側(cè)邊堿基的溶解溫度，降低穩(wěn)定性。由于分子的異質(zhì)性往往對其臨床開發(fā)有害， 未來的RNA靶向藥物可能會從最近開發(fā)的PS修飾寡核苷酸立體選擇性合成技術(shù)中 受益，如Wave Life Sciences已經(jīng)開發(fā)了一種可擴(kuò)展的方法來合成在每個PS鏈上具 有固定立體化學(xué)的寡核苷酸，并正在開發(fā)具有固定立體化學(xué)的寡核苷酸藥物用于各 種適應(yīng)癥。PS修飾另一個缺點是它們降低了寡核苷酸對其靶標(biāo)的結(jié)合親和力，這一 限制可以通過合并其他類型的修飾來彌補(bǔ) 值得注意的是，PS修飾提升藥物對細(xì)胞核酸酶的耐藥性，這會導(dǎo)致藥物組織滯 留和持久的藥物作用，為應(yīng)對例如由于長時間基因沉默而產(chǎn)生的毒性等不良反應(yīng)， 一個或多個PO鍵的結(jié)合可以通過降低其核酸酶的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)寡核苷酸的耐久性。

2’端核糖修飾以及核苷酸橋連策略

核苷酸橋接（BNAs）是通過在核苷酸的第 2和第4個碳原子之間的橋連而被限制在固定構(gòu)象中，最常用橋連策略是LNA、cEt、 ENA。BNAs增強(qiáng)了藥物對核酸酶的抗性以及對靶mRNA的親和力（在LNA中，每個 修飾過的核苷酸的熔解溫度增加3~8℃）。雖然BNA修飾的核苷酸與RNase h并不相 容，然而BNA修飾可被納入Gapmer ASO的側(cè)翼區(qū)域或也可被用于空間位阻的ASO 中以改善靶標(biāo)結(jié)合。值得注意的是，LNA修飾的RNA靶向藥物在部分臨床中觀察到 了肝毒性與腎毒性，增加了序列相關(guān)的風(fēng)險，后續(xù)需繼續(xù)關(guān)注。

其他修飾策略

嗎啉代寡核苷酸（PMO）是一類功能強(qiáng)大的合成寡核苷酸類似 物，在核酸藥物發(fā)展史上屬于第3代反義寡核苷酸，PMO的電中性嗎啉結(jié)構(gòu)使其具 有結(jié)合親和性高和抗酶解穩(wěn)定性強(qiáng)的特點。到目前為止，已經(jīng)有兩種PMO修飾的藥 物（Eteplirsen和Golodirsen）已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)上市。PMO具有高穩(wěn)定性和安全性的特點，由于在生理pH值下是中性的，不支持RNase H1活性，因此它們主要用于空間位阻機(jī)制的藥物。PMO修飾的一個缺點是 其缺乏與白蛋白結(jié)合能力導(dǎo)致較低的PK特性，這意味著可以通過腎臟排泄迅速清除 導(dǎo)致療效較低，因此需加大藥物劑量。值得注意的是，PMO主鏈包含手性中心，這 意味著PMO藥物必然是外消旋的混合物。與上述PS修飾不同的是，迄今為止還沒有 研究過定義PMO立體化學(xué)的影響。

遞送系統(tǒng)

 不管化學(xué)修飾如何，RNA靶向藥物的大小、親水性和電荷對體循環(huán)、組織外滲、 細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸都對藥物開發(fā)構(gòu)成了另外的挑戰(zhàn).因為核酸藥物需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并完成內(nèi)體逃脫才能發(fā)揮藥理作用。為了克服核酸藥物的細(xì)胞攝取與內(nèi)體逃脫效 率低等障礙，遞送系統(tǒng)對于提升藥物靶向性和生物利用度是必要的。
目前，針對RNA 靶向藥物開發(fā)的遞送系統(tǒng)主要包括脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）、聚合物、核酸納米結(jié)構(gòu)、 外泌體等，RNA靶向藥物也可以共價結(jié)合到特定的配體上。范圍從相對較小的分子 （如適配體、GalNAc等）到大分子（如多肽、抗體等Bioconjugation），配體定向輸送有望改善針對特定類型細(xì)胞的靶向性。

脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）

最初是作為siRNA藥物在體內(nèi)的遞送系統(tǒng)而開發(fā)的， LNPs 是一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（~100 nm），也被用于在體內(nèi)傳遞mRNA等大RNA分子。
LNPs在臨床應(yīng)用的缺點是其傳遞主要局限于肝臟和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，因為該組織的竇狀毛細(xì)血管上皮提 供了足夠大的空間，允許這些相對較大的納米顆粒進(jìn)入，此外LNPs的局部遞送已被成功地用于將siRNA遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。LNPs可以被多肽、PEG或其他賦予細(xì)胞特異性靶向的配體進(jìn)一步功能化。然而， 值得注意的是，LNPs復(fù)雜性的增加會使其制造復(fù)雜化并可能增加其毒性，這是一個 可能限制其臨床應(yīng)用的主要問題。例如，LNPs包裹的siRNA藥物（如Patisiran）在 靜脈注射以前需要用類固醇和抗組胺藥進(jìn)行預(yù)處理，以消除不必要的過敏反應(yīng)。此外，生物可降解的離子化脂類可能在未來2~5年內(nèi)進(jìn)入臨床前開發(fā)階段，有望大幅提升藥物的耐受劑量。

GalNAc

是核酸藥物靶向肝細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛的配體，目前在臨床試驗中大約有三分之一的 RNA靶向藥物是與多價GalNAc配體結(jié)合的，靶向肝細(xì)胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體 （ASGPRs），大幅提升了核酸藥物的靶向性和生物利用度。肝實質(zhì)細(xì)胞表面高水平表達(dá)三聚體ASGPRs，在中性pH下ASGPRs可以特異 性與GalNAc結(jié)合，并在酸性環(huán)境（pH值5~6）時釋放GalNAc，隨后釋放出來的 ASGPRs可以被回收到細(xì)胞表面進(jìn)行重用。因此，肝臟的適宜生理條件、ASGPRs 的獨特特性、GalNAc配體的無毒性質(zhì)和偶聯(lián)的簡便性使其成為一種接近理想的全身核酸藥物遞送到肝細(xì)胞的方法。
此外，GalNAc結(jié)合的寡核苷酸可以通過SC（表皮和真皮以下的脂肪組織）注 射實現(xiàn)高效給藥。皮下注射的藥物釋放到體循環(huán)的速度較慢，也可以進(jìn)入淋巴系統(tǒng)， 這給細(xì)胞受體更多的時間來調(diào)節(jié)吸收，同時皮下注射也更加快捷和容易，減少了治 療負(fù)擔(dān)。更重要的是，目前臨床上GalNAc結(jié)合的寡核苷酸藥物相關(guān)的皮下給藥相關(guān)局部不良事件發(fā)生率較低，而且額外安全性和耐受性將明顯支持更少的每周一次給藥，這是與LNPs遞送系統(tǒng)的比較優(yōu)勢。

適配體

治療性寡核苷酸與核酸適配體的偶合也被用于增強(qiáng)siRNA和ASO靶向遞送。適配體可以被認(rèn)為是化學(xué)抗體，而且可以被設(shè)計成小的納米結(jié)構(gòu)（約20nm），這意味著肝外傳遞是可能的。目前，國內(nèi)景澤生物正在開發(fā)基于 DNA四面體框架核酸載體平臺，用于寡核苷酸、小分子等藥物的遞送。 其他多種遞送系統(tǒng)也在臨床中開發(fā)中，本文未一一羅列。

結(jié)語

 

通過特定的化學(xué)修飾可提高藥物安全性、代謝穩(wěn)定性、靶向性、結(jié)合親和力和沉默效果，大幅拓展了藥物的治療窗口，因此化學(xué)修飾的絕對必要性在RNA靶向藥物的臨床開發(fā)早期挫折中已經(jīng)得到了充分證明。

遞送系統(tǒng)是限制全球RNA靶向藥物發(fā)展的主要瓶頸，脂質(zhì)納米顆粒（LNPs） 與N-乙?；肴樘前罚℅alNAc）已經(jīng)在獲批上市的核酸藥物中得到了驗證，其他多種遞送系統(tǒng)的開發(fā)也在臨床中正在進(jìn)行驗證。聲明：以上內(nèi)容僅供參考，不構(gòu)成投資/用藥建議。

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— THE END —

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