：本發(fā)明屬于酶工程和食品工程，具體涉及一種乳糖酶酶分子的定向進化、定點突變及其催化應(yīng)用。

背景技術(shù)

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背景技術(shù)：

1、低聚糖又稱寡糖類，是指單糖分子通過糖苷鍵連接的、聚合度為2-10的直鏈或支鏈碳水化合物，可簡單分為功能性低聚糖和普通低聚糖兩大類。其中，功能性低聚糖(functional oligosaccharides)是指由2-10個相同或不同的單糖以糖苷鍵聚合而成，具有溫和的甜味和感官特性，可作為脂肪和糖的部分代替物用于食品中并改善食品質(zhì)地，但不被人體腸道酶消化，并到達大腸，作為生長因子促進雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌增殖，增強礦物質(zhì)吸收，降低血脂、膽固醇和血糖指數(shù)，改善血壓，對人體健康產(chǎn)生有益的影響。

2、低聚半乳糖(galactooligosaccharides，gos)是一種天然存在人乳、牛乳、羊乳中的功能性低聚糖，是一種重要的益生元，對人類健康發(fā)揮了重要作用。上世紀50年代，已有報道利用β-半乳糖苷酶催化乳糖生產(chǎn)低聚半乳糖的工業(yè)化技術(shù)相關(guān)研究，國際上gos產(chǎn)品于1988年成功上市。低聚半乳糖的生產(chǎn)，主要以乳糖為原料，利用乳糖酶的轉(zhuǎn)糖基作用在乳糖水解過程中合成含一個葡萄糖或全部為半乳糖分子連接的低聚合度的寡糖，可表示為gal-(gal)n-glc/gal(n為1-4)。

3、乳糖酶(β-半乳糖苷酶的一種，ec 3.2.1.23)能夠通過其轉(zhuǎn)半乳糖基作用生成gos，是一種在乳品工業(yè)中非常具有商業(yè)價值的酶。用于生產(chǎn)gos的商品化乳糖酶一般來源于黑曲霉(a.niger)、米曲霉(a.oryzae)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyces lactis)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis)、羅倫特隱球菌(cryptococcus laurentii)和環(huán)狀芽胞桿菌(bacillus circulans)等菌株。不同來源的乳糖酶在酶活組成和轉(zhuǎn)苷活性上有一定差別，同時gos的生產(chǎn)工藝不同，但催化合成的低聚半乳糖主要以β-1,3、β-1,4、β-1,6糖苷鍵連接，其中以β-1,4糖苷鍵為主。此外，針對酶的耐高溫性能，研究開發(fā)出一些新型的耐高溫乳糖酶。如嗜熱硫礦硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)、直桿糖多孢菌(saccharopolyspora rectivirgula)、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)和海棲熱袍菌(thermotoga maritima)等微生物來源的乳糖酶，可以在70℃-80℃高溫下催化合成gos?，F(xiàn)有商品化乳糖酶，一般可以乳糖為原料形成5％-50％的低聚半乳糖。環(huán)狀芽胞桿菌atcc31382生產(chǎn)出的乳糖酶(如)，是目前為止合成gos能力最強的乳糖酶，這個酶在酶制劑產(chǎn)品中有4中不同的存在形式(song j,abe k,imanaka h,imamura k,minoda m,yamaguchi s,and nakanishi k,biosci.biotechnol.biochem.,2011；75,268-278)，其中，β-gal-c和β-gal-d被認為是最有價值用于gos的生產(chǎn)。從環(huán)狀芽胞桿菌b2301中鑒定出的乳糖酶，具有在60℃以上的高溫條件下催化乳糖形成54.5％的gos，是目前所有報道的乳糖酶中g(shù)os合成性能最好的乳糖酶(趙繼華等，食品與發(fā)酵工業(yè)，2020)；高產(chǎn)乳糖酶的重組菌株-地衣芽胞桿菌bcbtbc168d發(fā)酵制備乳糖酶bcbg168-d的表達水平顯著提高(中國發(fā)明專利，zl202011051056.1)，實現(xiàn)了低聚半乳糖生產(chǎn)專用酶的高效制備。

4、在應(yīng)用于工業(yè)化制備低聚半乳糖的過程中也發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀芽胞桿菌乳糖酶催化乳糖中的半乳糖基轉(zhuǎn)糖基體系中，反應(yīng)終了仍然會出現(xiàn)高比例的底物乳糖的殘留，通常殘留在25％-30％，明顯增大了低聚半乳糖特別是高純度低聚半乳糖的制備成本。此外，進一步提高其催化活性，也將會明顯降低其應(yīng)用過程的用酶成本并有可能進一步降低低聚半乳糖的制造成本。因此本技術(shù)通過對乳糖酶的3d結(jié)構(gòu)分析和底物/產(chǎn)物分子對接，獲得乳糖酶分子中有可能提高酶活的可能突變位點，再通過定點突變并進行異源表達制備突變體，檢測其酶活及其催化產(chǎn)物形成特征，獲得了一種催化活力顯著提升的高活性乳糖酶，可應(yīng)用于高效催化乳糖為低聚半乳糖，并有利于降低乳糖酶的制備成本。

技術(shù)實現(xiàn)思路

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明的目的是通過定向分子進化獲得相應(yīng)的乳糖酶突變體，提高其催化乳糖合成低聚半乳糖的活性并顯著降低反應(yīng)體系中底物乳糖的剩余量，由此可顯著改善乳糖酶的應(yīng)用性能并擴展其應(yīng)用領(lǐng)域，提升乳糖酶工業(yè)規(guī)模下制造效率。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以乳糖酶bcbg168-d編碼基因(序列表seq id no.1所示核苷酸序列)或其氨基酸序列(序列表seq id no.2所示)為基礎(chǔ)，分析可能發(fā)生突變的氨基酸殘基(其中所描述的乳糖酶突變位點選擇是根據(jù)原始乳糖酶分子bcbg168-d(序列表seq id no.2)與葡萄糖分子對接并分析結(jié)果獲得)，通過定點突變制備突變體，通過突變體的表達與定向篩選，獲得性能優(yōu)良的乳糖酶突變體，分析評價其酶促應(yīng)用性能，并評價其在低聚半乳糖制備中的應(yīng)用價值。

3、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一，是一種乳糖酶突變體，所述乳糖酶突變體是在seqid no.2所示原始乳糖酶的基礎(chǔ)上發(fā)生氨基酸序列中的氨基酸殘基t446單點突變獲得的；

4、進一步，所述乳糖酶突變體是在seq id no.2所示的氨基酸殘基t446上的突變，可以是被其余19種氨基酸殘基任意替換，即：蘇氨酸殘基可以用丙氨酸(ala，a)【此突變記為：t446→t446a，以此類推】、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、組氨酸(his，h)、異亮氨酸(ile，i)、甘氨酸(gly，g)、天冬酰胺(asn，n)、亮氨酸(leu，l)、賴氨酸(lys，k)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、絲氨酸(ser，s)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)或纈氨酸(val，v)替換；

5、優(yōu)選地，所述乳糖酶突變體是在seq id no.2所示原始乳糖酶的基礎(chǔ)上發(fā)生t446v、t446f、t446k、t446m、t446n、t446c、t446w突變中的任意一種獲得的；

6、更優(yōu)選地，所述乳糖酶突變體是在seq id no.2所示原始乳糖酶的基礎(chǔ)上發(fā)生t446v或t446n獲得的；

7、進一步地，所述乳糖酶突變體為氨基酸序列如seq id no.4所示的t446v。

8、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二，是上述乳糖酶突變體的編碼基因。

9、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三，是包含上述編碼基因的重組載體或重組菌株；

10、進一步地，所述重組載體采用的表達載體為phy-wzx質(zhì)粒；

11、進一步地，所述重組菌株采用的宿主為地衣芽胞桿菌bcbt0529(已公布在中國發(fā)明專利zl202011051056.1中)；

12、更進一步地，所述重組菌株是將所述乳糖酶突變體編碼基因克隆入表達載體phy-wzx，在地衣芽胞桿菌bcbt0529宿主細胞中進行重組表達獲得。

13、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四，是上述重組載體或重組菌株的應(yīng)用，特別是在生產(chǎn)技術(shù)方案一所述乳糖酶突變體中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之五，是技術(shù)方案一所述乳糖酶突變體的應(yīng)用，特別是在生產(chǎn)低聚半乳糖中的應(yīng)用。

15、有益效果：

16、本發(fā)明中的乳糖酶突變體，為通過定向分子進化獲得的、具有催化乳糖生成低聚半乳糖的高活性乳糖酶突變體，其中t446v突變體比酶活提高71.1％，并且反應(yīng)體系中，底物乳糖的殘余量顯著降低，減低了5.54％。本發(fā)明乳糖酶新分子具有更好的應(yīng)用于低聚半乳糖制備的效率、提高產(chǎn)品質(zhì)量并同步降低生產(chǎn)成本，連帶有助于提高新表達菌種的產(chǎn)酶水平和進一步降低乳糖酶發(fā)酵制備的成本。

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