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導(dǎo)讀  

替莫唑胺(TMZ)是治療膠質(zhì)瘤的首選化療藥物。作為第二代烷基化試劑，TMZ在口服類(lèi)藥物中具有較好的生物有效性。然而，低有效率(低于50%)和高耐藥率嚴(yán)重限制了TMZ的應(yīng)用，目前仍然缺乏提高其化療敏感性的策略。本研究構(gòu)建了Luci-GL261膠質(zhì)瘤原位異種移植模型，并結(jié)合生物發(fā)光成像來(lái)評(píng)估TMZ的抗腫瘤作用，并區(qū)分了TMZ敏感(S)和非敏感(NS)個(gè)體。整合微生物組學(xué)和代謝組學(xué)分析來(lái)揭示腸道細(xì)菌在TMZ敏感性中的作用。采用Spearman相關(guān)分析來(lái)探究糞便細(xì)菌水平與藥效學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性?？股靥幚砺?lián)合TMZ治療用于驗(yàn)證腸道菌群參與TMZ反應(yīng)。采用流式細(xì)胞儀分析、ELISA和組織病理學(xué)方法探討免疫調(diào)節(jié)在腸道菌群介導(dǎo)的TMZ反應(yīng)中的潛在作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤發(fā)展和TMZ治療過(guò)程中，腸道細(xì)菌組成發(fā)生了顯著變化。同時(shí)，體內(nèi)抗癌評(píng)估顯示TMZ給藥后化療效果有顯著差異。此外，16s rRNA基因測(cè)序和非靶向代謝組學(xué)分析顯示，TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠的腸道菌群和免疫浸潤(rùn)狀態(tài)存在明顯差異，而差異腸道菌群及相關(guān)代謝物的豐度與TMZ藥效學(xué)指標(biāo)顯著相關(guān)。進(jìn)一步的驗(yàn)證表明，抗生素處理可加速膠質(zhì)瘤的發(fā)展，減弱TMZ的療效，抑制免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和CD8α+ T細(xì)胞)的募集。綜上所述，本研究證實(shí)了腸道菌群通過(guò)免疫調(diào)節(jié)參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展和TMZ的個(gè)體化療效，因此腸道菌群可作為臨床應(yīng)用TMZ的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。  

論文ID

原名：Gut microbiota mediated the individualized efficacy of Temozolomide via immunomodulation in glioma

譯名：腸道菌群通過(guò)免疫調(diào)節(jié)介導(dǎo)替莫唑胺在膠質(zhì)瘤中的個(gè)體化療效

期刊：Journal of Translational Medicine

IF：8.44

發(fā)表時(shí)間：2023.3

通訊作者：孫賓蓮，劉鈺晨

通訊作者單位：江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部

DOI號(hào)：10.1186/s12967-023-04042-5

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1 多組學(xué)研究表明膠質(zhì)瘤的發(fā)展導(dǎo)致小鼠腸道菌群失調(diào)  

為了探究腸道菌群在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用，我們構(gòu)建了Luci-GL261膠質(zhì)瘤原位異種移植模型。在第14天時(shí)，利用生物發(fā)光成像對(duì)異種移植模型進(jìn)行了驗(yàn)證(圖1A和附加文件1:圖S1)。同時(shí)，在第14天時(shí)采集對(duì)照組和模型組小鼠的糞便樣本進(jìn)行16s rRNA測(cè)序分析。

α-多樣性指數(shù)顯示，膠質(zhì)瘤的發(fā)展并沒(méi)有顯著影響微生物群落的豐富度(Chao1、Shannon和Simpson)(附加文件1:圖S2)。但是，對(duì)照組和模型組之間的β-多樣性存在顯著差異，這表明膠質(zhì)瘤的發(fā)展導(dǎo)致了腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的失調(diào)(圖1B)。具體而言，如圖1C所示，對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，平均占35.58%)，而模型組中的優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌門(mén)(Bacteroides，平均占52.16%)。在屬水平上，相似性百分比分析結(jié)果顯示，阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、雙歧桿菌(Bifdobacterium)、Ligilactobacillus等是導(dǎo)致對(duì)照組和模型組小鼠之間差異的關(guān)鍵因素(附加證據(jù)1:圖S3)。此外，KEGG通路富集分析顯示，對(duì)照組小鼠ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加，而模型組小鼠聚酮糖單位生物合成、鞘糖脂生物合成、氨基酸代謝等代謝途徑增加(p<0.01)(圖1D)。

最近的研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物在腸道微生物與宿主相互作用中的重要作用。因此，本研究利用非靶向代謝組學(xué)的分析方法，通過(guò)比較對(duì)照組和模型組糞便樣本中的微生物相關(guān)代謝物，來(lái)探究其在膠質(zhì)瘤發(fā)展中的潛在作用。從LC-MS(+)和LC-MS(-)數(shù)據(jù)集得出的PCA評(píng)分圖中，我們觀察到QCs緊密聚類(lèi)，這表明代謝組學(xué)方法是穩(wěn)健可行的(附加問(wèn)題1:圖S4A)。然后建立了OPLS-DA模型來(lái)比較兩組之間的差異(圖1E)。500次迭代的置換檢驗(yàn)表明，OPLS-DA模型沒(méi)有過(guò)度擬合(附加問(wèn)題1:圖S4B)。只有滿足VIP>1、p<0.05和fold change>2的才被選擇進(jìn)行代謝物注釋(圖1F)。總共鑒定出64種代謝物，主要包括氨基酸、短鏈脂肪酸(SCFAs)、脂肪酸、膽汁酸、二肽等(附加項(xiàng)1:表S1)。此外，KEGG富集分析強(qiáng)調(diào)了對(duì)照組和模型組之間的色氨酸/谷氨酸代謝、亞麻酸代謝、脂肪酸生物合成途徑水平不同(附加報(bào)告1:圖S4C)。綜上所述，多組學(xué)研究表明，在膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程中，腸道菌群有很大的變化。

圖1. 膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)小鼠腸道菌群及相關(guān)代謝產(chǎn)物生態(tài)失調(diào)。

A，模型組小鼠膠質(zhì)瘤原位異種移植模型構(gòu)建及模型組小鼠第14天的代表性生物發(fā)光圖像(BLI)。B，采用加權(quán)wilcox評(píng)價(jià)對(duì)照組和模型組腸道菌群的β多樣性指數(shù)。C，對(duì)照組和模型組細(xì)菌在門(mén)和屬水平上的分類(lèi)分布。D，對(duì)照組和模型組小鼠腸道菌群不同豐度的KEGG通路。E，基于LC-MS (+) (R2X= 0.242, R2Y= 0.967, Q2=0.69)和LC-MS (-) (R2X=0.491, R2Y=0.801, Q2=0.629)數(shù)據(jù)的OPLS-DA評(píng)分圖。F，對(duì)照組與模型組間LC-MS(+)和LC-MS(-)差異代謝物的火山圖，其fold change>2，p<0.05。  

2  TMZ 治療改變了腸道菌群分布并增加了其多樣性

鑒于觀察到了腸道菌群失調(diào)與膠質(zhì)瘤之間的聯(lián)系，本研究接下來(lái)探究了TMZ治療(膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)化療策略)對(duì)小鼠腸道菌群的影響。收集TMZ治療前(模型組，第14天收集)和治療后(TMZ，第21天收集)小鼠的糞便樣本，分別進(jìn)行16s rRNA測(cè)序和代謝組學(xué)分析(圖2A)。與之前報(bào)道的結(jié)果一致，TMZ治療逆轉(zhuǎn)了膠質(zhì)瘤引起的腸道菌群失調(diào)。TMZ治療后，α-多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon和Simpson)顯著升高(p<0.001)，表明微生物群落的豐富度和多樣性升高(圖2B)。同時(shí)，兩組間β-多樣性也存在顯著差異(p<0.01)(圖2C)。在門(mén)水平上，TMZ小鼠以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為主(平均占52.04%)，而模型組以擬桿菌門(mén)(Bacteroides)為主(附加案例1:圖S5A)。具體來(lái)說(shuō)，包括阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等17個(gè)細(xì)菌屬的豐度在模型組小鼠和TMZ組小鼠之間存在顯著差異(附件1:圖S5B、C)。此外，KEGG通路富集分析顯示，氨基酸、脂質(zhì)、葡萄糖和核苷酸代謝活性在兩個(gè)集群之間存在差異(附件1:圖S6)。

糞便樣本的非靶向代謝組學(xué)分析進(jìn)一步表明TMZ治療后腸道菌群代謝譜發(fā)生了變化(圖2D)。QC樣本在PCA評(píng)分圖中很好地聚類(lèi)(附加項(xiàng)1:圖S7A)，置換檢驗(yàn)(500次)表明模型沒(méi)有過(guò)度擬合(附加項(xiàng)1:圖S7B)。在模型組和TMZ組之間，包括氨基酸、寡肽、膽酸、短/長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝的61種代謝產(chǎn)物最終被注釋為顯著差異代謝物(VIP > 1, p < 0.05，fold change> 2)(附加項(xiàng)1:表S2)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，TMZ逆轉(zhuǎn)了由膠質(zhì)瘤原位異種移植引起的腸道菌群失調(diào)，并增加了腸道菌群多樣性。

圖2. TMZ給藥導(dǎo)致腸道菌群分布發(fā)生顯著變化。

A，膠質(zhì)瘤原位異種移植模型的構(gòu)建及TMZ治療。B，TMZ治療前(Model)和治療后小鼠腸道菌群α-多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon和Simpson)。C，用加權(quán)wilcox評(píng)價(jià)模型組小鼠和TMZ治療小鼠腸道菌群的β多樣性指數(shù)。D，基于LC-MS (+) (R2X=0.262, R2Y=0.972, Q2=0.798)和LC-MS (-) (R2X=0.642, R2Y=0.867, Q2=0.708)數(shù)據(jù)的OPLS-DA評(píng)分圖。E，模型小鼠和TMZ治療小鼠間LC-MS(+)和LC-MS(-)差異代謝物的火山圖，其fold change>2和p<0.05。  

3 TMZ敏感和非敏感個(gè)體給藥前糞便樣本中的腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝物顯著不同  

作為膠質(zhì)瘤化療的一線策略，TMZ反應(yīng)的高度異質(zhì)性是部分患者預(yù)后不良的原因。最近的研究表明，包括MGMT突變、腫瘤免疫微環(huán)境、炎癥體、PI3K/Akt通路等在內(nèi)的多種因素可影響TMZ的個(gè)體化療效，但目前尚缺乏提高化療敏感性的策略。我們的研究結(jié)果充分證實(shí)了腸道菌群在膠質(zhì)瘤的發(fā)展和TMZ治療中的作用。然而，腸道菌群是否能夠介導(dǎo)荷瘤小鼠對(duì)TMZ的敏感性仍然未知。因此，本研究隨后構(gòu)建了Luci-GL2611膠質(zhì)瘤原位異種移植模型(第7天)，小鼠在腫瘤注射后第7天隨機(jī)分為模型組(n=10)和TMZ組(n=40)(圖3A)。腫瘤發(fā)展和TMZ治療均導(dǎo)致荷瘤小鼠體重顯著下降(圖3B)。根據(jù)腫瘤抑制率(相對(duì)總flux=第21天Flux/第14天Flux)，將TMZ治療小鼠分為T(mén)MZ敏感組(S組，抑制率>30%，n=13)和TMZ非敏感組(NS組，抑制率<-200%，n=14)。如圖3C所示，TMZ治療在S組和NS組抗腫瘤效果上有顯著差異。同時(shí)，TMZ S小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移和Ki67水平也明顯受到抑制(圖3D)。這些結(jié)果證實(shí)了TMZ在一些接種傳統(tǒng)TMZ抗性GL261細(xì)胞個(gè)體中是有效的，表明其他關(guān)鍵因素也影響了TMZ的效果。隨后，我們對(duì)S組和NS組給藥前的糞便樣本進(jìn)行了16s rRNA基因測(cè)序分析和非靶向代謝組學(xué)分析，以探討腸道菌群及相關(guān)代謝產(chǎn)物是否與TMZ治療膠質(zhì)瘤的敏感性有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，S組和NS組之間的α-多樣性(Chao1、Shannon和Simpson)無(wú)顯著差異(圖4A)，而用β-多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明腸道菌群分布具有顯著差異(圖4B)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NS個(gè)體中Bacteroides的豐度(59.05%)明顯高于S組(38.97%)(附件1:圖S8A)。這一結(jié)果與模型組Bacteroides豐度(52.16%)高于對(duì)照組(33.54%)相一致(圖1C)。進(jìn)一步的篩選顯示，S組和NS組小鼠腸道菌群中阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、Alloprevotella、Muribaculum、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)的豐度差異最大(圖4C和附件1:圖S8B)。同時(shí)，代謝組學(xué)分析顯示，與腸道微生物相關(guān)的代謝水平存在顯著差異(附加報(bào)告1:圖S9A, B和圖4D)?；贙EGG通路的功能預(yù)測(cè)也表明，S組和NS組小鼠給藥前的糞便樣本之間的色氨酸代謝、類(lèi)固醇生物合成和鞘脂代謝水平存在顯著差異(附加文件1:圖S9C)。Spearman相關(guān)分析表明，糞便樣本中變化細(xì)菌的豐度與代謝物之間存在顯著相關(guān)性(附加報(bào)告1:圖S10)。隨后的分析顯示，差異腸道菌群和代謝物的豐度與藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)顯著相關(guān)(圖4E和附件1:圖4E:S11)。簡(jiǎn)而言之，本部分揭示了TMZ敏感和非敏感個(gè)體的腸道菌群具有不同的分布特征和功能，而腸道細(xì)菌在TMZ療效中的潛在作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

圖3 TMZ敏感(S)和非敏感(NS)個(gè)體的識(shí)別。

A，膠質(zhì)瘤原位異種移植模型構(gòu)建及TMZ治療流程。B，膠質(zhì)瘤發(fā)展和TMZ給藥對(duì)小鼠體重的影響。采用相對(duì)總通量(第14天Flux/第7天Flux)和對(duì)TMZ S (n=13)和NS (n=14)小鼠的腫瘤抑制率評(píng)價(jià)TMZ的療效。D，S和NS小鼠的代表性照片、BLI圖像、HE染色和免疫組化(Ki67)。

圖4 不同的腸道菌群分布和代謝產(chǎn)物可能有助于個(gè)體化TMZ療效。

A，TMZ S和NS小鼠腸道菌群α-多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon和Simpson)。B，采用加權(quán)wilcox評(píng)價(jià)TMZ S和NS個(gè)體腸道菌群β多樣性指數(shù)。C，在S和NS小鼠之間細(xì)菌屬發(fā)生顯著變化。D，基于LC-MS (+) (R2X=0.236, R2Y=0.794, Q2=-0.522)和LC-MS (-) (R2X=0.475, R2Y=0.808, Q2=0.569)數(shù)據(jù)的OPLS-DA評(píng)分圖。E，TMZ治療后藥效學(xué)指標(biāo)與變化細(xì)菌屬/代謝物豐度的Spearman相關(guān)系數(shù)熱圖。顏色的強(qiáng)度表示藥效學(xué)指標(biāo)水平與變化的細(xì)菌屬/代謝物豐度之間的關(guān)聯(lián)程度。p值<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*p<0.05，**p<0.01。

4 對(duì)TMZ治療反應(yīng)不同的小鼠免疫浸潤(rùn)有顯著差異

腸道菌群可通過(guò)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)介導(dǎo)疾病的發(fā)展和藥物反應(yīng)。眾所周知，免疫逃逸是膠質(zhì)瘤的特征之一。我們推測(cè)腸道細(xì)菌通過(guò)免疫調(diào)節(jié)來(lái)影響TMZ敏感性。因此，我們分別在第21天收集TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠的血清，測(cè)定其IL-1β和TNF-α濃度。如圖5A所示，敏感個(gè)體的IL-1β和TNF-α水平明顯升高，表明膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)的免疫抑制在敏感小鼠中被逆轉(zhuǎn)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一推測(cè)，我們采用免疫組織化學(xué)方法評(píng)估了第21天巨噬細(xì)胞(F4/80)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8α)的浸潤(rùn)程度。雖然對(duì)照組和模型組小鼠之間沒(méi)有明顯變化(圖5B)，但在TMZ敏感小鼠的大腦和腫瘤組織中，巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的百分比明顯更高(圖5C)。綜上所述，我們的研究表明TMZ敏感個(gè)體的免疫浸潤(rùn)增強(qiáng)。

圖5 TMZ敏感和非敏感小鼠免疫浸潤(rùn)的差異。

A，S和NS小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的變化。對(duì)照組、模型組(B)、S組和NS組(C)小鼠CD8α、F4/80免疫組化和定量分析，p值<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*p<0.05。  

5 ABX給藥抑制了TMZ的療效和免疫細(xì)胞的募集

在確認(rèn)TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和免疫浸潤(rùn)的差異后，我們想進(jìn)一步研究腸道菌群在個(gè)體化TMZ敏感性中的作用。廣譜抗生素雞尾酒(ABX)，由氨芐西林、甲硝唑、硫酸新霉素和萬(wàn)古霉素組成的經(jīng)典抗生素組合。ABX已被廣泛認(rèn)為足以耗盡所有可檢測(cè)到的共生細(xì)菌。因此，采用ABX處理來(lái)根除荷瘤小鼠的腸道菌群(圖6A)，ABX處理如預(yù)期那樣導(dǎo)致小鼠體重的進(jìn)一步下降(圖6B)。后續(xù)對(duì)TMZ在治療有/無(wú)腸道菌群的小鼠腫瘤的評(píng)估結(jié)果顯示，ABX略微促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)展(p>0.05)，而TMZ療效顯著減弱(p<0.05)(圖6C, D)。同時(shí)，腸道菌群缺失后，腫瘤的侵襲能力和Ki67水平明顯升高(圖6E)。這些結(jié)果證實(shí)了腸道細(xì)菌參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展和TMZ抗膠質(zhì)瘤的功效。

此外，免疫組化顯示ABX聯(lián)合后(TMZ vs ABX-TMZ)腦和腫瘤組織中巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的募集減少(圖7A)。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，TMZ治療后大腦中巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的募集增加(模型vs TMZ)，而ABX聯(lián)合TMZ治療腫瘤后巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞水平下降(ABX-模型vs ABX-TMZ)，表明腸道菌群確實(shí)通過(guò)免疫調(diào)節(jié)介導(dǎo)了TMZ的療效(圖7B)。綜上所述，微生物組學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合證明，腸道菌群可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)影響膠質(zhì)瘤原位異種移植模型的TMZ個(gè)體化療效。

圖6 廣譜抗生素(ABX)處理對(duì)TMZ療效的影響。

A，ABX處理實(shí)驗(yàn)流程。B，TMZ和ABX給藥對(duì)小鼠體重的影響。C，各組小鼠總通量變化。D，相對(duì)總通量(第14天Flux/第7天Flux)評(píng)價(jià)化療療效。E，各組小鼠代表性照片、HE染色及免疫組化(Ki67)。 

圖7 廣譜抗生素(ABX)治療對(duì)荷瘤小鼠免疫浸潤(rùn)的影響。小鼠F4/80和CD8α的免疫組化(A)和流式細(xì)胞儀分析(B)。  

討論

替莫唑胺作為膠質(zhì)瘤的一線化療方案，在治療膠質(zhì)瘤方面已顯示出優(yōu)于單純放療的優(yōu)勢(shì)。然而，TMZ相對(duì)較低的有效率限制了其治療效果，影響了患者的預(yù)后。因此，揭示影響TMZ化療效果的潛在關(guān)鍵因素至關(guān)重要。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤發(fā)展和TMZ治療期間，腸道菌群發(fā)生了顯著變化。同時(shí)，膠質(zhì)瘤原位異種移植模型對(duì)TMZ治療表現(xiàn)出明顯的敏感性。我們發(fā)現(xiàn)TMZ敏感小鼠和非敏感小鼠的給藥前糞便樣本中的腸道細(xì)菌分布和免疫浸潤(rùn)水平具有顯著差異。此外，ABX處理進(jìn)一步證實(shí)了腸道菌群介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)在個(gè)體化TMZ療效中的作用。綜上所述，我們的研究表明腸道菌群通過(guò)免疫調(diào)節(jié)影響TMZ的個(gè)體化療效(圖8)。

圖8 腸道菌群通過(guò)免疫調(diào)節(jié)介導(dǎo)TMZ個(gè)體化療效的示意圖。  

與之前的研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展和TMZ治療都能夠影響小鼠腸道菌群分布特征和相關(guān)代謝產(chǎn)物(圖1、2)，這表明腸道菌群在膠質(zhì)瘤病理進(jìn)展和TMZ治療反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。了解腸道菌群在TMZ治療中的潛在機(jī)制是很有趣的。我們的研究發(fā)現(xiàn)，TMZ在高達(dá)30%的患TMZ耐藥膠質(zhì)瘤的小鼠(GL261細(xì)胞)中仍然有效(圖3)，這表明TMZ的功效還涉及其他關(guān)鍵因素。因此，我們分析了敏感小鼠和非敏感小鼠的腸道微生物分布特征和代謝水平。我們發(fā)現(xiàn)兩組之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著不同。并且腸道差異菌群及相關(guān)代謝產(chǎn)物的豐度與TMZ的藥效學(xué)評(píng)價(jià)顯著相關(guān)(圖4)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，ABX預(yù)處理可顯著減弱TMZ的抗腫瘤作用，證實(shí)了腸道菌群對(duì)TMZ個(gè)體化療效的關(guān)鍵作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道菌群異質(zhì)性的存在及其在化療中的作用。本研究的結(jié)果支持膠質(zhì)瘤發(fā)展的現(xiàn)象以及對(duì)TMZ治療的個(gè)體化敏感性。

眾所周知，腸道菌群可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)間接影響化療。炎癥通路如NF-κB通路、STAT3信號(hào)通路等以及相關(guān)炎癥因子(ILs、TNFs、IFNs等)在腸道細(xì)菌介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中都起著重要的作用。特別是，已知IL-1β和TNF-α是腸-腦軸相互作用的重要介質(zhì)。本研究觀察到了TMZ S和NS個(gè)體血清中炎癥因子(IL-1β、TNF-α)水平的差異。在腦組織和腫瘤中，巨噬細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的存在也有所不同(圖5)。這些結(jié)果證實(shí)了腸道微生物群通過(guò)免疫調(diào)節(jié)影響TMZ的治療效果。進(jìn)一步的研究表明，ABX處理降低了膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠的免疫浸潤(rùn)，從而逆轉(zhuǎn)了TMZ的抗腫瘤作用(圖7)。這些數(shù)據(jù)有力地證明了免疫系統(tǒng)參與了腸道細(xì)菌介導(dǎo)的TMZ個(gè)體化反應(yīng)。

腸道菌群代謝產(chǎn)物能夠反映腸道微生物，并且在腸道微生物與宿主相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在本研究中，基于KEGG通路的功能預(yù)測(cè)表明，S組和NS組之間的色氨酸代謝水平存在顯著差異(附加報(bào)告1:圖S9)。先前的研究已經(jīng)證實(shí)，腸道菌群可以將膳食中的色氨酸轉(zhuǎn)化為色胺、犬尿氨酸和吲哚衍生物。色氨酸及其相關(guān)代謝產(chǎn)物是塑造免疫微環(huán)境來(lái)影響膠質(zhì)瘤發(fā)展的關(guān)鍵微環(huán)境因子。具體來(lái)講，腸道菌群可以通過(guò)IDO1將色氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸。犬尿氨酸和IDO1均被認(rèn)為是機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子。AHR作為細(xì)菌吲哚和犬尿氨酸的重要傳感器，在細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤免疫微環(huán)境中也起著關(guān)鍵作用。同時(shí)，Yang等人證實(shí)色氨酸代謝酶色氨酸羥化酶1可通過(guò)5-羥色胺/L1CAM/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展?；谏彼岽x與膠質(zhì)瘤發(fā)展及TMZ療效之間的顯著相關(guān)性(附加file 1:圖S9, S4C和圖4E)，我們推測(cè)IDO1和AHR是細(xì)菌色氨酸代謝的潛在靶點(diǎn)。本研究的初步結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的AHR水平明顯高于模型組小鼠；與非敏感個(gè)體相比，TMZ敏感小鼠的AHR水平也有所增加(附加研究1:圖S12)。這些結(jié)果表明，改變的色氨酸代謝物可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)展和TMZ的療效。但腸道微生物衍生色氨酸及其相關(guān)代謝物在TMZ療效中的生物學(xué)功能及其潛在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究強(qiáng)調(diào)了腸道菌群和相關(guān)免疫調(diào)節(jié)在TMZ治療的個(gè)體化反應(yīng)中的重要作用。因此，腸道菌群對(duì)TMZ療效的作用需要基于臨床樣本和患者來(lái)源的異種移植模型進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，本研究首次在敏感小鼠和非敏感小鼠之間鑒定出了4個(gè)具有顯著差異的細(xì)菌屬，因此探究這4個(gè)差異細(xì)菌類(lèi)群移植對(duì)TMZ抗腫瘤作用的影響是很有意義的。此外，本研究?jī)H證實(shí)了免疫調(diào)節(jié)參與腸道菌群介導(dǎo)的TMZ療效，但其潛在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究確定了腸道菌群在TMZ抗癌作用中的關(guān)鍵作用。特別是，TMZ敏感和非敏感個(gè)體之間的腸道菌群分布特征和免疫浸潤(rùn)存在差異。此外，ABX處理加速了膠質(zhì)瘤的發(fā)展，逆轉(zhuǎn)了TMZ的抗腫瘤作用，加重了癌癥引起的免疫抑制。本研究揭示了腸道菌群通過(guò)免疫調(diào)節(jié)參與個(gè)體化TMZ療效，因此腸道菌群可能作為膠質(zhì)瘤治療的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。闡明腸道微生物群及其代謝物的各自作用可能為在膠質(zhì)瘤治療中使用替莫唑胺進(jìn)行精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)干預(yù)提供機(jī)會(huì)。

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