本發(fā)明涉及微生物及農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域，具體而言，涉及一種黑木耳破壁方法。
背景技術(shù)：
：黑木耳(auriculariaauricula-judae)又稱木耳、耳子、光木耳，屬真菌門擔(dān)子菌綱，營(yíng)養(yǎng)極為豐富，被譽(yù)為“人體清道夫”和“食品阿司匹林”。是我國(guó)珍貴的藥食膠質(zhì)真菌，在我國(guó)多數(shù)地區(qū)都有生產(chǎn)，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量90％以上?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)黑木耳具有抗凝血、抗腫瘤、抗炎癥等細(xì)胞保護(hù)作用，還具有降低血脂、血糖、血液粘稠、膽固醇以及抗糖尿病、抗衰老、抗輻射、抗疲勞等多種生理功能，同時(shí)還能促進(jìn)核酸、蛋白質(zhì)的生物合成并預(yù)防多種老年性疾病。近年來(lái)已經(jīng)成為食品、醫(yī)療、保健等領(lǐng)域研究和開發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)。但是，由于黑木耳子實(shí)體細(xì)胞壁較厚，其關(guān)鍵組分幾丁質(zhì)及少量葡聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使其質(zhì)地異常堅(jiān)韌，破壁難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞等，人體消化吸收效果較差。有研究表明，通常情況下，食用木耳的吸收利用率只有40％左右，只有通過(guò)破壁，才可以大幅度提高黑木耳在人體內(nèi)的吸收率及生物利用度。目前木耳破壁的方法主要有：機(jī)械法、酸堿法、酶解技術(shù)等。采用機(jī)械法、酸堿法破壁，設(shè)備投資大，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，運(yùn)行成本高，破壁不完全。而采用酶解破壁的方法，由于黑木耳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，尚缺乏專一性的酶。如需要破壁完全，常需要使用多種酶：如溶菌酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等，導(dǎo)致成本高、工藝復(fù)雜。因此，尋找一種更簡(jiǎn)單、更有效、成本更低的黑木耳破壁的方法，是很有意義的。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服黑木耳子實(shí)體細(xì)胞壁堅(jiān)固，食用后吸收利用率低的不足，本發(fā)明的目的是提供一株具有分泌幾丁質(zhì)酶能力的暹羅芽孢桿菌及其在黑木耳破壁方面的應(yīng)用，從而促使黑木耳子實(shí)體中的營(yíng)養(yǎng)成分充分溶出，大幅度提高黑木耳的生物利用率。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明涉及一種黑木耳破壁方法，包括：將黑木耳與暹羅芽孢桿菌酶液共孵育，酶解破壁；所述暹羅芽孢桿菌菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：cgmccno.12903；保藏時(shí)間為：2016年8月24日。該菌種拉丁學(xué)名為bacillussiamensis，中文學(xué)名為暹羅芽孢桿菌，菌株名為jaashd，從吉林省水稻主產(chǎn)區(qū)健康仔豬的新鮮糞樣中分離獲得。上述的經(jīng)過(guò)分離純化的暹羅芽孢桿菌，采用lb培養(yǎng)基，恒溫37℃培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)，鏡檢菌體呈桿狀，直徑大約為0.5～0.6μm×1.3～2.9μm；平板生長(zhǎng)出菌落呈奶白色，圓形，微凸，濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊。另外，對(duì)于該菌株，經(jīng)過(guò)純化后測(cè)序，其16srdna序列如seqidno:1所示。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌酶液的制備方法包括：將暹羅芽孢桿菌發(fā)酵液離心，取上清液即得。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌發(fā)酵液為將所述暹羅芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)得到，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基；優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述lb培養(yǎng)基的成分包括：蛋白胨8～12g/l、酵母粉2～4g/l、氯化鈉4～6g/l、葡萄糖2～4g/l；ph＝6.2～7.0。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，將所述暹羅芽孢桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：35℃～42℃，搖床150～240rpm，od600值0.8～1.0時(shí)終止培養(yǎng)。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌酶液的制備方法還包括，將所述上清液過(guò)濾除菌。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述黑木耳磨成粉后再與所述暹羅芽孢桿菌酶液共孵育。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述暹羅芽孢桿菌發(fā)酵液中活菌數(shù)≥2億/ml。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述黑木耳與所述暹羅芽孢桿菌酶液的添加比例為10～30g：100ml。優(yōu)選的，如上所述的黑木耳破壁方法，所述酶解的條件為36℃～38℃酶解24h～48h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：該暹羅芽孢桿菌菌株對(duì)于黑木耳子實(shí)體具有很好的破壁效果，同時(shí)，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、工藝穩(wěn)定、設(shè)備投入少等優(yōu)勢(shì)，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為暹羅芽孢桿菌jaashd系統(tǒng)發(fā)育樹。本申請(qǐng)?zhí)峁┑腻吡_芽孢桿菌(bacillussiamensis)，菌株名為jaashd，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏時(shí)間為：2016年8月24日，保藏編號(hào)cgmccno.12903。經(jīng)保藏中心于2016年8月24日檢測(cè)為存活菌株。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例11、菌株初篩采集吉林省各地健康仔豬新鮮糞樣10份，分別稱取10g樣品，加入90ml無(wú)菌生理鹽水，制備成樣品懸液，經(jīng)80℃水浴處理后，取100μl10-2、10-3、10-4稀釋液涂布于lb培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度涂布三個(gè)平行，恒溫37℃培養(yǎng)48小時(shí)，然后采用平板劃線法，純化芽孢桿菌菌株，分別編號(hào)保存。獲得122株芽孢桿菌。2、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶芽孢桿菌初步篩選將分離得到的菌株點(diǎn)種到上述以幾丁質(zhì)粉為唯一碳源的分離平板上，37℃培養(yǎng)16～48小時(shí)，如果生長(zhǎng)出的菌落周邊出現(xiàn)透明水解圈，說(shuō)明培養(yǎng)基中幾丁質(zhì)已經(jīng)被菌株分泌的酶水解，進(jìn)而證明菌株具有分泌幾丁質(zhì)酶的能力。經(jīng)過(guò)初步篩選，得到4株具有幾丁質(zhì)酶分泌能力的菌株，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步篩選分析。3、黑木耳破壁菌的進(jìn)一步篩選將上述分離得到4株具有幾丁質(zhì)酶分泌能力的菌株點(diǎn)種到上述以黑木耳粉為唯一碳源的分離平板上，37℃培養(yǎng)16～48小時(shí)，如果生長(zhǎng)出的菌落周邊出現(xiàn)透明水解圈，說(shuō)明培養(yǎng)基中黑木耳粉已經(jīng)被菌株分泌的酶水解，進(jìn)而證明菌株具有黑木耳破壁的能力。4、黑木耳破壁能力檢測(cè)采用上述菌株的菌懸液或發(fā)酵液粗提物處理黑木耳粉，以可溶性物質(zhì)含量作為破壁效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出破壁能力強(qiáng)的菌株。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選及破壁能力檢測(cè)，得到1株具有較好黑木耳破壁能力的菌株，命名為jaashd，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。5、菌株鑒定按照“伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)”(第八版)和“常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京：科學(xué)出版社，2001.2)中描述菌種分類鑒定的方法，對(duì)菌株jaashd進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下：采用lb培養(yǎng)基，恒溫37℃培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)，鏡檢菌體呈桿狀，直徑大約為0.5～0.6μm×1.3～2.9μm；平板生長(zhǎng)出菌落呈奶白色，圓形，微凸，邊緣整齊。生理生化特征：結(jié)果如表1、2所示。表1暹羅芽孢桿菌jaashd生理生化試驗(yàn)特性指標(biāo)結(jié)果特性指標(biāo)結(jié)果氧化酶+三丁酸甘油脂水解-精氨酸雙水解酶-硝酸鹽還原-明膠水解+七葉靈水解+淀粉水解+酪素水解+過(guò)氧化氫酶+tween80水解-吲哚實(shí)驗(yàn)-檸檬酸利用-脲酶-h2s生成-vp實(shí)驗(yàn)+厭氧生長(zhǎng)+10％nacl+50℃生長(zhǎng)+14％nacl+ph4.5生長(zhǎng)-55℃生長(zhǎng)+備注：-表示陰性反應(yīng)；+表示陽(yáng)性反應(yīng)，+-表示弱陽(yáng)性反應(yīng)。表2暹羅芽孢桿菌jaashd糖發(fā)酵試驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果甘油+七葉靈+d-阿拉伯糖-水楊苷+d-核糖+d-纖維二糖+d-木糖+d-麥芽糖+d-葡萄糖+d-乳糖+d-果糖+d-蜜二糖-肌醇+d-蔗糖+甘露醇+d-松三糖+山梨醇+d-棉籽糖+α-甲基-d-葡萄糖苷+淀粉+n-乙酰葡糖胺+糖原+苦杏仁苷+d-龍膽二糖+海藻糖-松二糖-熊果苷+l-阿拉伯醇+-備注：-表示陰性反應(yīng)；+表示陽(yáng)性反應(yīng)，+-表示弱陽(yáng)性反應(yīng)。6、分子生物學(xué)特性提取jaashd的總dna，以其為模板，利用細(xì)菌16srdna通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1.5kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得的序列如seqidno:1所示。將測(cè)序結(jié)果與gen-bank序列同源性比較，然后用軟件mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，菌株jaashd與bacillusssiamensisstrainpd-a10(genbank登錄號(hào)nr_117274.1)同源性為99％，并處于系統(tǒng)發(fā)育樹同一分支?；诰w形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化、16srdna鑒定結(jié)果特征，將菌株jaashd鑒定為bacillusssiamensis。建議的分類命名為暹羅芽孢桿菌；該菌株已于2016年8月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為cgmccno.12903。實(shí)施例2暹羅芽孢桿菌jaashd破壁黑木耳粉的制備粗酶液制備：將菌株jaashd接種于lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于35℃搖床，240rpm，搖到od600值0.8取出。在6000rpm條件下離心20min，棄沉淀，上清液在0.22um條件下過(guò)濾，即得粗酶液。所述lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：蛋白胨12g/l、酵母粉2g/l、氯化鈉4g/l、葡萄糖2g/l，去離子水1000ml；ph＝6.2。121℃高壓滅菌20min。對(duì)黑木耳子實(shí)體破壁：將黑木耳粉按10％(w/v)加入粗酶液，輕輕搖勻后，36℃～38℃靜止酶解24h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。實(shí)施例3暹羅芽孢桿菌jaashd破壁黑木耳粉的制備粗酶液制備：將菌株jaashd接種于lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于42℃搖床，150rpm，搖到od600值1.0取出。在10000rpm條件下離心15min，棄沉淀，上清液在0.22um條件下過(guò)濾，即得粗酶液。所述lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：蛋白胨8g/l、酵母粉4g/l、氯化鈉6g/l、葡萄糖4g/l，去離子水1000ml；ph＝7.0。121℃高壓滅菌20min。對(duì)黑木耳子實(shí)體破壁：將黑木耳粉按30％(w/v)加入粗酶液，輕輕搖勻后，36℃～38℃靜止酶解48h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。實(shí)施例4暹羅芽孢桿菌jaashd破壁黑木耳粉的制備粗酶液制備：將菌株jaashd接種于lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于37℃搖床，200rpm，搖到od600值0.9取出。在8000rpm條件下離心20min，棄沉淀，上清液在0.22um條件下過(guò)濾，即得粗酶液。所述lb液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：蛋白胨10g/l、酵母粉3g/l、氯化鈉5g/l、葡萄糖3g/l，去離子水1000ml；ph＝6.8。121℃高壓滅菌20min。對(duì)黑木耳子實(shí)體破壁：將黑木耳粉按20％(w/v)加入粗酶液，輕輕搖勻后，36℃～38℃靜止酶解36h后烘干，制得破壁的黑木耳粉。實(shí)驗(yàn)例暹羅芽孢桿菌jaashd對(duì)黑木耳破壁能力的檢測(cè)1)按實(shí)施例4的方法制備得到粗酶液。準(zhǔn)確稱取1.00g黑木耳粉兩份，一份加入100ml粗酶液搖勻，另一份加入100ml實(shí)施例4中的lb發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37℃條件下保溫60min，然后分別在8000rpm條件下離心20min。各取濾液20ml，分別在50～80℃烘干至恒重，以可溶性物質(zhì)含量作為黑木耳破壁效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算方法為：可溶性物質(zhì)含量(％)＝干重×5×100/黑木耳粉重量。通過(guò)測(cè)定，加入空白培養(yǎng)基的對(duì)照可溶性物質(zhì)含量為0.98％，而加入jaashd菌株發(fā)酵濾液的可溶性物質(zhì)含量達(dá)到62.83％，證明該菌株的代謝產(chǎn)物對(duì)黑木耳有很好的破壁效果。2)準(zhǔn)確稱取1.00g黑木耳粉兩份，一份加入100ml實(shí)施例4中的lb發(fā)酵培養(yǎng)基，并接入菌株jaashd。另一份加入100ml實(shí)施例4中的lb發(fā)酵培養(yǎng)基做為空白對(duì)照。置于35～42℃搖床，150～240rpm，搖至od600值0.8～1.0取出。分別在8000rpm條件下離心20min。各取濾液20ml，分別在50～80℃烘干至恒重，以可溶性物質(zhì)含量作為黑木耳破壁效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。計(jì)算方法為：可溶性物質(zhì)含量(％)＝干重×5×100/黑木耳粉重量。通過(guò)測(cè)定，空白對(duì)照的可溶性物質(zhì)含量為0.91％，而加入jaashd菌株的樣品可溶性物質(zhì)含量達(dá)到60.76％，證明該菌株對(duì)黑木耳有很好的破壁效果。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>一種黑木耳破壁方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1508<212>dna<213>bacillussiamensis<400>1agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagc60ggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaa120cctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttga180accgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcg240cattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagag300ggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagg360gaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtttt420cggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcacctt480gacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtag540gtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtct600gatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgca660gaagaggagggtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacacc720agtggcgaaggcgactctctggtcggtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcg780aacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttaggggg840tttccgccccttagtgcggcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgc900aagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaaccggtggagcatgtggtttaa960ttcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatgctctgccaatcctagagatag1020gacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagcccgtgtcgtg1080agatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagt1140tgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatc1200atcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcg1260aaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaac1320tcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgctgcggtgaatacgt1380tcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggt1440gaggtaatctttatggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgta1500acaaggta1508當(dāng)前第1頁(yè)12

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