前言

自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPSC）技術(shù)問世以來，干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)取得了重大進(jìn)展。iPSC是指通過對體細(xì)胞進(jìn)行人基因的重編程，逆分化培養(yǎng)出的一類具有類似胚胎干細(xì)胞（ESC）特征的多能干細(xì)胞。iPSC技術(shù)可溯源至2006年，日本京都大學(xué)的科學(xué)家山中伸彌（Shinya Yamanaka）團(tuán)隊借助病毒載體將4個轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc導(dǎo)入小鼠的成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化形成iPSC[1]。

2007年，Yamanaka團(tuán)隊成功地將人類體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為與人類ESC（hESC）具有相似基因表達(dá)譜和多能性的干細(xì)胞[2]，這些細(xì)胞被稱為人類iPSC（hiPSC）。該技術(shù)于2012年獲得諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎，自此關(guān)于iPSC的研究在全球范圍內(nèi)全面展開。

hESC存在最大的難題就是用人類受精卵培養(yǎng)的倫理問題，而iPSC技術(shù)為這一難題提供了完美的解決方案。iPSC來源廣泛，具有較強的體外擴增、復(fù)制和分化能力、較低的免疫原性、較高的基因編輯效率等。基于這些優(yōu)勢，iPSC技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)[3]，是個性化細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)研究的重要科學(xué)工具。

圖1 來源于iPSC的特定細(xì)胞和類器官在疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞治療中的應(yīng)用[3]

研發(fā)進(jìn)展

2020年，QYRESEARH報告顯示，iPSC市場的全球收入在2019年價值8052萬美元，預(yù)計到2025年將達(dá)到1.6億美元，預(yù)計全球收入的復(fù)合年增長率為12.26％[4]。

圖2 2014-2025年全球誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞市場規(guī)模和增長率（百萬美元）[4]

根據(jù)“Clinicaltrials.gov”數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，截至2023年3月底，有關(guān)iPSC的臨床試驗有137項。自2015年開始，iPSC相關(guān)臨床試驗數(shù)量有顯著提升，于2018年達(dá)到峰值并有所回落，到2022年臨床試驗數(shù)量再度增長，為15個[5]。

圖3 全球iPSC相關(guān)臨床試驗[5]

iPSC管線最快的已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床（Cynata Therapeutics），大部分處于Ⅰ期臨床及臨床前階段。

表1 全球進(jìn)入臨床階段的iPSC治療產(chǎn)品[5-7]

iPSC來源的在研產(chǎn)品適應(yīng)癥以腫瘤為主（43%），帕金森、眼科疾病和心力衰竭次之。最多的iPSC衍生細(xì)胞類型是CAR-iNK（27%），多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞、CAR-iMac和i-MSC緊隨其后[5]。

圖4 全球iPSC在研產(chǎn)品按適應(yīng)癥拆分

圖5 全球iPSC在研產(chǎn)品按衍生種類拆分

制備

制備流程

iPSC衍生的同種異體產(chǎn)品的生產(chǎn)過程可分為三個主要階段[8]。

第一階段，供體材料（即細(xì)胞）通過引入重編程基因（如Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc [OKSM]）而經(jīng)歷重編程過程，這些重編程基因由病毒或非病毒重編程載體瞬時表達(dá)。重編程的細(xì)胞可以進(jìn)行擴增和儲存，建立iPSC庫，成為一個具有無限擴增能力的可再生細(xì)胞來源。多能干細(xì)胞在未分化狀態(tài)下擴增的能力使得其在后續(xù)過程中可以進(jìn)行更廣泛的遺傳修飾和更大規(guī)模的生產(chǎn)。

第二階段，可對重編程iPSC進(jìn)行進(jìn)一步的基因修飾，利用病毒載體、非病毒基因編輯組件（如質(zhì)粒DNA、mRNA、RNA復(fù)制子）、酶（如CRISPR/Cas9）或轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因編輯引入產(chǎn)品特異性的基因修飾。基因修飾會破壞內(nèi)源基因，或引入與產(chǎn)品功能相關(guān)的基因。

第三階段，在進(jìn)行基因修飾后，可對經(jīng)過修飾的細(xì)胞進(jìn)行克隆篩選步驟（即克隆過程），在這一步驟中，可擴增克隆并篩選多個克隆，以挑選具有適當(dāng)性能特征的單克隆用于后續(xù)的生產(chǎn)。挑選的克隆可以擴增產(chǎn)生種子細(xì)胞，再進(jìn)一步擴增為主細(xì)胞庫（MCB）。

iPSC衍生的異體細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)過程可始于MCB復(fù)蘇。在某些情況下，可以使用兩級庫策略，WCB（工作細(xì)胞庫）可以從MCB擴增。來自MCB或WCB的iPSC通常在未分化狀態(tài)下擴增，以達(dá)到所需的生產(chǎn)規(guī)模，并進(jìn)一步加工以誘導(dǎo)分化成為預(yù)期的細(xì)胞表型；加工過程包括分化、成熟或激活以產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的原液。然后配制、灌裝和低溫保存，成為最終的藥品。

圖6 iPSC衍生的同種異體細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)過程[8]

iPSC制備的關(guān)鍵因素

iPSC的制備受多種因素影響，其中細(xì)胞來源的選擇、重編程因子的篩選、重編程載體的選擇、培養(yǎng)基和培養(yǎng)基質(zhì)、培養(yǎng)方式和iPSC的篩選鑒定等均為關(guān)鍵因素。

1、細(xì)胞來源的選擇[9]

iPSC最初是從小鼠成纖維細(xì)胞中建立的，因為這些細(xì)胞易于處理、能大量增殖。然而，人類原代成纖維細(xì)胞的建立需要皮膚活檢，這涉及侵入性外科手術(shù)和專業(yè)技能。因此人們開始尋求更容易獲得的細(xì)胞來源。外周血細(xì)胞是一種理想的細(xì)胞來源，iPSC可以來源于T細(xì)胞、B 細(xì)胞、造血干細(xì)胞和纖維細(xì)胞。

iPSC也可以從毛囊中分離的角質(zhì)形成細(xì)胞、牙齒和脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和尿液中的腎上皮細(xì)胞、胚胎和胚胎外組織樣臍帶血和羊膜細(xì)胞、胃和肝細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞以及黑色素細(xì)胞中重編程獲得。

總之，人體中的所有細(xì)胞都有可能成為iPSC，但效率不同。選擇細(xì)胞來源時值得考慮的一點是，即使在重新編程后，iPSC也可以保持部分原始表觀遺傳狀態(tài)。雖然這種記憶可以通過長時間的培養(yǎng)來消除，但它會影響iPSC的分化能力。受體細(xì)胞類型也會影響基因傳遞方法的選擇，因為它會影響基因傳遞的效率。

2、重編程因子的篩選[9]

在OSKM中，Oct3/4、Sox2和Klf4作為維持iPSC多能性的基因的正調(diào)節(jié)因子，會抑制分化基因的表達(dá)。第四個因子c-Myc被證明對于重編程是不必要的，但它的使用顯著提高了效率。c-Myc在重編程機制激活多能調(diào)節(jié)因子之前發(fā)揮作用，其影響的是細(xì)胞增殖，而不是多能性。

此前，由James Thomson領(lǐng)導(dǎo)的一個研究小組使用Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28誘導(dǎo)體細(xì)胞形成hiPSC。自這一發(fā)現(xiàn)以來，研究人員已經(jīng)證明，將一種特定的體細(xì)胞類型重編程為iPSC狀態(tài)，使該細(xì)胞有可能變成體內(nèi)任何類型的細(xì)胞。除了OSKM和Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28外，轉(zhuǎn)錄因子Glis1和Nr5a2可以分別替代c-Myc和Oct3/4，Sall4可以顯著提高效率。細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)因子cyclin D1和TP53也可以作為c-Myc的替代品。

研究表明，miRNA或控制miRNA合成的基因（miR-302、miR-372和Lin28）和表觀基因組修飾因子（Suv39h 、Wrd5和Jhdm1a）也能有效地進(jìn)行重編程。作用于表觀遺傳學(xué)的小分子可以通過修飾DNA甲基化（5-aza-cytidine和RG108）、組蛋白乙?；ǘ∷徕c和trichostatin A）或組蛋白甲基化（Neplanocin A）來提高重編程效率。此外，研究發(fā)現(xiàn)小分子化合物也能夠替代重編程轉(zhuǎn)錄因子。例如，8-br-cAMP是cAMP依賴性蛋白激酶的激活劑，可增強人成纖維細(xì)胞重編程效率。最后，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1型受體抑制劑 Alk5可以通過激活Nanog表達(dá)來促進(jìn)iPSC重編程。

3、重編程載體的選擇[3,9-15]

根據(jù)載體類型的不同，目前誘導(dǎo)重編程的載體大致可以分為整合型和非整合型。

3.1 整合型載體

（1）病毒整合型載體，常利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體等實現(xiàn)基因重編程。最初iPSC的制備使用的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，用于表達(dá)外源重編程因子，附著到細(xì)胞表面后，該載體將重編程基因引入受感染的細(xì)胞，并將其整合到宿主基因組中。慢病毒載體具有相似的特性，且具有更高的重編程效率和更少的變異性。這些病毒系統(tǒng)有利于因子高表達(dá)、持續(xù)表達(dá)和高效的iPSC生成，但整合型病毒會帶來安全性風(fēng)險，包括細(xì)胞毒性、細(xì)胞免疫反應(yīng)、轉(zhuǎn)基因整合到宿主基因組以及非特異性突變的產(chǎn)生[9]。

（2）非病毒整合型載體，如轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子是基于DNA的載體，其中PiggyBac轉(zhuǎn)座子是一種常用的方法。PiggyBac轉(zhuǎn)座子可攜帶重編程因子，在催化酶轉(zhuǎn)座酶的作用下整合到宿主基因組中，但其可以在iPSC生成后利用PiggyBac編碼的轉(zhuǎn)座酶將外源基因從宿主基因組中切除。在大多數(shù)情況下，這種切除不會在基因組上留下任何痕跡，使iPSC臨床應(yīng)用的風(fēng)險大大減小[9]。

3.2 非整合型載體

（1）病毒非整合型載體，如腺病毒載體降低了轉(zhuǎn)基因被重新激活的風(fēng)險，但重編程效率低，產(chǎn)生的iPSC不能達(dá)到與臨床應(yīng)用相適應(yīng)的水平。仙臺病毒是單鏈RNA，在細(xì)胞核外進(jìn)行復(fù)制，被認(rèn)為是最安全的病毒方法，通過對仙臺病毒進(jìn)行刪除F基因并引入溫度敏感性突變進(jìn)行修飾，可阻止基因傳遞并減少重編程載體的傳播，包含在細(xì)胞質(zhì)中的病毒載體最終會被稀釋掉，從而留下無印跡的iPSC[9-13]。

（2）非病毒非整合型載體，如來自EB病毒的包含EBNA-1和OriP兩種DNA序列的附加體型質(zhì)粒已顯示出良好的應(yīng)用前景。該質(zhì)粒在感染人細(xì)胞后表達(dá)EBNA-1蛋白，然后識別OriP序列以誘導(dǎo)質(zhì)粒的游離擴增。OriP和EBNA-1序列可確保在每次細(xì)胞分裂期間重編程載體的復(fù)制和保留，從而驅(qū)動重編程基因的高表達(dá)并促進(jìn)單次轉(zhuǎn)染后的iPSC產(chǎn)生。每個細(xì)胞周期附加體型載體的丟失速率約為5%，因此iPSC生產(chǎn)過程中可自行去除載體而無需額外的操作，從而產(chǎn)生不含轉(zhuǎn)染DNA和整合入基因的無印跡iPSC[9,14,15]。

直接導(dǎo)入RNA的方法也可以生成iPSC。如修飾的核苷酸用于合成編碼重編程因子的RNA。這些修飾的RNA的重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)已從人成纖維細(xì)胞和外周血中生成了iPSC。由于轉(zhuǎn)導(dǎo)的RNA通過干擾素途徑誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，因此使用牛痘病毒的重組B18R蛋白來最大程度地降低這種風(fēng)險。這種方法被認(rèn)為比基于DNA的方法具有更低的致突變風(fēng)險。也有報道用重組蛋白生成iPSC，在這項技術(shù)中，重編程因子與細(xì)胞穿透肽融合以促進(jìn)它們在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。

上述方法具有不同的重編程效率、技術(shù)難度和基因組整合性。應(yīng)根據(jù)iPSC的應(yīng)用目的，判斷使用哪種方法應(yīng)基于該技術(shù)的效率和安全性。對于臨床應(yīng)用，無論效率如何，安全性都是最重要的。最初的重編程方法被禁止臨床應(yīng)用，是因為逆轉(zhuǎn)錄病毒對c-Myc的穩(wěn)定基因組整合增加了重編程細(xì)胞致瘤的風(fēng)險。理想情況下，外源重編程因子不會整合到宿主細(xì)胞染色體中。仙臺病毒和DNA載體（例如附加體型質(zhì)粒）提供了這種可能性，已被廣泛應(yīng)用?；赗NA或蛋白質(zhì)的方法整合風(fēng)險最低，但它們在技術(shù)上仍然存在困難[9]。

圖7 產(chǎn)生iPSC的各種細(xì)胞來源和重編程方法[3]

4、培養(yǎng)基和培養(yǎng)基質(zhì)[16,17]

在擴增過程中控制iPSC質(zhì)量的關(guān)鍵是使用特性良好的原材料，其中細(xì)胞培養(yǎng)基和基質(zhì)起著重要作用[16]。

在設(shè)計iPSC培養(yǎng)基時，一種策略方法是確定多能性依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中涉及的生長因子。調(diào)控干細(xì)胞多能性基因水平的通路多種多樣，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β超家族激活級聯(lián)反應(yīng)、受體酪氨酸激酶信號通路（堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF））、Rho/ROCK（Rho依賴性蛋白激酶）信號通路等[16, 17]。

TGF-β超家族蛋白，例如TGF-β 蛋白、激活素、Nodal和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （BMP），在維持iPSC的多能性方面也發(fā)揮著重要作用。TGF-β1已被證明有助于維持hiPSC 的多能性。Nodal和激活素A激活相同的受體和信號傳導(dǎo)，以抑制hiPSC分化并維持多能性。

然而，高濃度（約100 ng/mL）的激活素A也會促進(jìn)hiPSC分化為中內(nèi)胚層細(xì)胞。因此，為了維持hiPSC的多能性，激活素A的濃度應(yīng)保持在50 ng/mL以下。BMP-4可誘導(dǎo)hiPSC的分化，拮抗劑noggin與bFGF共同抑制BMP-4誘導(dǎo)hiPSC分化的作用并維持hiPSC的多能性[17]。

bFGF對于hiPSC的多能性和增殖至關(guān)重要。然而，由于bFGF缺乏熱穩(wěn)定性，因此需要頻繁更換介質(zhì)，這增加了大規(guī)模生產(chǎn)的成本。使用一些方法，如使用控釋微球穩(wěn)定bFGF水平和改進(jìn)bFGF熱穩(wěn)定性，可降低培養(yǎng)基更換頻率[17]。

ROCK抑制劑如Y-27632和thiazovivin在hiPSC的生產(chǎn)中具有重要作用。研究表明添加 ROCK抑制劑可顯著提高h(yuǎn)iPSC傳代后的細(xì)胞存活率、提高h(yuǎn)iPSC冷凍保存效率、促進(jìn)hiPSC擴增和增強hiPSC分化[17]。

通過提供特定的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），以飼養(yǎng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的基質(zhì)，可防止iPSC自發(fā)分化，并改善iPSC的貼壁。支持iPSC生長最常用的飼養(yǎng)細(xì)胞是滅活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，它們產(chǎn)生多種對多能性維持至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，如TGF-β1、激活素A、多營養(yǎng)因子（肝素結(jié)合生長因子）等。然而，由于飼養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力有限，重復(fù)傳代后支持iPSC多能性的效率降低，以及在iPSC分離過程中存在高污染風(fēng)險，在飼養(yǎng)層條件下大規(guī)模生產(chǎn)iPSC仍存在技術(shù)挑戰(zhàn)。

此外，動物源性飼養(yǎng)基質(zhì)可能增加人畜共患病原體和未知病毒向宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，從而導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。因此，iPSC培養(yǎng)方法逐漸過渡到使用ECM蛋白、條件培養(yǎng)基或合成生物材料的無飼養(yǎng)層（feeder-free, Ff）和無異源（xeno-free, Xf）培養(yǎng)系統(tǒng)。在已開發(fā)的無動物成分（animal component-free，ACF）培養(yǎng)基中，Essential 8?（Thermo Fisher Scientific）培養(yǎng)基是iPSC培養(yǎng)最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其含有干細(xì)胞增殖最基本的八種元素：DMEM/F12、l -抗壞血酸、磷酸鎂、硒鈉、FGF-2、胰島素、NaHCO3和轉(zhuǎn)鐵蛋白、TGF-β1或Nodal[16]。

生物材料如水凝膠可促進(jìn)細(xì)胞保持多能性。ECM，如纖連蛋白、層粘連蛋白和玻連蛋白，或來自ECM的寡肽，具有特定的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這使得它們成為支持iPSC在無飼養(yǎng)層系統(tǒng)中生長的重要成分。另外，3D生物打印和細(xì)胞/組織打印技術(shù)也為未來的工藝擴增和自動化解鎖了更多的可能性[16]。

5、培養(yǎng)方式[16]

細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)在決定iPSC的最終行為和整個生產(chǎn)過程的成本方面起著關(guān)鍵作用。盡管在一次性多層板式生物反應(yīng)器中已經(jīng)證明了iPSC在2D靜態(tài)培養(yǎng)中可以大規(guī)模擴增，并且能夠監(jiān)測和反饋控制pH和溶解氧（DO），但2D或3D靜態(tài)培養(yǎng)條件是一種需要大量人力、金錢成本和空間的方法，且會對培養(yǎng)基成分、代謝廢物/產(chǎn)物、旁分泌因子和氣體產(chǎn)生不利影響。動態(tài)懸浮培養(yǎng)是實現(xiàn)臨床應(yīng)用所需的iPSC密度的最佳方法，懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵考慮因素包括聚集體、微載體和微膠囊等。

（1）聚集體

由于iPSC具有粘附特性，在懸浮培養(yǎng)時，會自發(fā)形成3D聚集體（或球體）。iPSC聚集體與擬胚體（EB）非常相似，因此可以作為擴增后直接譜系分化的一種方式。iPSC聚集體的生長和多能性主要取決于微環(huán)境、聚集體大小和分布，以及細(xì)胞培養(yǎng)容器大小。通過優(yōu)化一次性生物反應(yīng)器的葉輪類型和攪拌速度，可以控制iPSC培養(yǎng)中的聚集體大小。通過補充培養(yǎng)基添加物，如維甲酸、類維生素A、ROCK抑制劑Y27632等，可以促進(jìn)iPSC聚集體形成、擴增并維持其多能性。

（2）微載體

應(yīng)用微載體進(jìn)行iPSC培養(yǎng)擴增已取得一定進(jìn)展。攪拌式微載體培養(yǎng)系統(tǒng)已被證明可以促進(jìn)貼壁依賴性干細(xì)胞的擴增和規(guī)?；a(chǎn)，為監(jiān)測和控制干細(xì)胞分化提供必要的條件，同時可以通過增強氧合和代謝物運輸以及降低微環(huán)境毒性來提高iPSC的產(chǎn)量。然而，微載體的直徑、密度和化學(xué)成分會影響細(xì)胞的附著，從而影響細(xì)胞的擴增能力。由于微珠的表面積有限，iPSC可達(dá)到的最大密度似乎受到微珠/細(xì)胞比率的限制。附著在微珠上的細(xì)胞需要酶解和過濾，可能會降低細(xì)胞的活力和多能性?？缮锝到獾奈⑤d體則可以解決這一問題。另外，通過優(yōu)化生物反應(yīng)器攪拌速率，也可盡量減少剪切應(yīng)力對iPSC活力和多能性的不利影響。

（3）微膠囊

與將細(xì)胞附著在微珠表面的微載體不同，微膠囊化是將細(xì)胞捕獲在球形膠囊內(nèi)。細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和其他生長因子可以通過球形膠囊擴散。球形膠囊由半透性材料或膜組成，在懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中可以保護(hù)細(xì)胞免受團(tuán)聚和剪切應(yīng)力的影響。聚合物微膠囊與凝膠微膠囊相比具有一定的優(yōu)勢，每單位體積的膠囊材料可以容納更多的細(xì)胞。此外，由于膠囊內(nèi)空間存在液體細(xì)胞懸浮液，膠囊中的iPSC擴增相對不受限。在微膠囊系統(tǒng)中培養(yǎng)的iPSC既可以維持多能性，也可以被誘導(dǎo)分化，取決于其膠囊的組成和微環(huán)境中存在的生長因子的類型。使用微膠囊大規(guī)模生產(chǎn)iPSC的缺點與微載體相似，如生產(chǎn)成本高，細(xì)胞生長表面積受限。

6、iPSC的篩選鑒定[5,18]

iPSC的篩選鑒定通常可以通過細(xì)胞形態(tài)、干性/多能性基因檢測、三胚層方向的分化標(biāo)志物檢測和畸胎瘤試驗等來進(jìn)行。一般情況下，iPSC應(yīng)呈克隆團(tuán)生長、克隆邊緣清晰、核質(zhì)比高、形態(tài)均一，克隆內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密接觸；iPSC細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的任意兩個陽性率≥70.0%，細(xì)胞內(nèi)部標(biāo)志物Oct4陽性率≥70%、Nanog陽性率≥70%。

iPSC具有向三胚層方向分化的能力，可通過檢測中胚層的平滑肌肌動蛋白（SMA），內(nèi)胚層的α-胎蛋白 （AFP）和外胚層的 β-III 微管蛋白（TUBB3/ TUJ1）來證明；iPSC經(jīng)皮下注射到免疫缺陷小鼠的背部，經(jīng)過一段時間后可產(chǎn)生畸胎瘤。

質(zhì)量控制

 iPSC來源產(chǎn)品制備工藝復(fù)雜, 生產(chǎn)使用過程涉及iPSC建庫、中間體細(xì)胞 （建庫，如適用）、細(xì)胞培養(yǎng)物收獲、凍存/新鮮制劑、臨床給藥等不同階段, 全過程各階段均需進(jìn)行必要的質(zhì)量控制。為了確保iPSC來源干細(xì)胞產(chǎn)品的安全性、有效性和批間一致性，應(yīng)對細(xì)胞庫和制劑進(jìn)行全面的檢定。質(zhì)量研究內(nèi)容可結(jié)合細(xì)胞特性進(jìn)行選擇，盡量覆蓋細(xì)胞特性分析、理化特性分析、純度和雜質(zhì)分析、安全性分析和生物學(xué)活性分析等方面，盡可能采用一系列先進(jìn)、正交的分析技術(shù)，且分析方法應(yīng)經(jīng)過研究確認(rèn)，確保方法適用可靠[19]。

表2 iPSC細(xì)胞庫檢定內(nèi)容 

表3 iPSC衍生細(xì)胞檢定內(nèi)容 

主要風(fēng)險

iPSC應(yīng)用場景快速發(fā)展，但臨床轉(zhuǎn)化仍然遇到了許多問題。目前，基于iPSC的細(xì)胞治療面臨最大的三個挑戰(zhàn)——致瘤性、免疫原性和異質(zhì)性[20]。

1、致瘤性

未分化/未成熟細(xì)胞引起的致瘤性：iPSC治療中最嚴(yán)重的問題無疑是畸胎瘤的形成。當(dāng)移植到患者體內(nèi)的最終產(chǎn)品存在殘留iPSC或高度增殖的祖細(xì)胞時，導(dǎo)致畸胎瘤或其他腫瘤。

重編程因子引起的致瘤性：這是iPSC細(xì)胞移植所特有的風(fēng)險。iPSC制備過程中的OSKM重編程因子均與致瘤性相關(guān)，尤其是c-Myc。另外，使用增加重編程效率的因子，如p53的顯性失活突變體等也會產(chǎn)生致瘤的影響。

基因突變引起的致瘤性：iPSC由于自身生物學(xué)特性以及體外較高的倍增次數(shù)，會比成體干細(xì)胞更容易產(chǎn)生和積累遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)變異，如染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常、基因拷貝數(shù)變異（CNV）和點突變（SNV和indel）等。但是，發(fā)生基因突變時，并不一定會增加腫瘤風(fēng)險，并非所有腫瘤基因突變都是致病的。健康的個體也存在腫瘤基因的突變，這就增加了風(fēng)險分析的復(fù)雜性。

2、免疫原性

細(xì)胞治療的另一個關(guān)鍵問題是免疫排斥反應(yīng)。臨床研究表明細(xì)胞自體移植可規(guī)避免疫應(yīng)答，但對于一些急性疾病，如心臟衰竭和脊髓受損等，自體移植在時效性方面并不能滿足要求。因此，異體移植比自體移植應(yīng)用更為廣泛，但異體移植不可避免會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

人類白細(xì)胞抗原（HLA）的特異性是免疫排斥產(chǎn)生的主要原因。人群中存在一類“超級供體”，其HLA基因5位點是高頻單倍體純合子，基于這些供體制備的細(xì)胞可覆蓋高數(shù)量的受體人群。此外，HLA隱藏技術(shù)也是解決該問題的一種免疫抑制方法，可通過刪除通用組件B2M基因并引入HLA-E和B2M等基因，制備通用細(xì)胞系。

3、異質(zhì)性

iPSC的異質(zhì)性是指在每個iPSC系中，其形態(tài)、生長曲線、基因表達(dá)和分化的傾向都有不同，而這種異質(zhì)性是iPSC后續(xù)應(yīng)用的主要障礙。遺傳變異和表觀遺傳修飾是導(dǎo)致iPSC產(chǎn)生異質(zhì)性的主要原因。目前，有的科研人員已嘗試?yán)蒙L因子與化學(xué)抑制劑組合等方式將iPSC由“啟動”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椤俺跏肌睜顟B(tài)，但技術(shù)仍不成熟，獲得的初始iPSC可能發(fā)生染色體異常和印記丟失等問題。

展望

iPSC技術(shù)建立以來，人們在再生醫(yī)學(xué)方面已取得了巨大進(jìn)展，隨著CRISPR/Cas9、3D類器官、微流體等為代表的新技術(shù)的出現(xiàn)和不斷革新，相信在不遠(yuǎn)的將來，iPSC的應(yīng)用會在個體化再生醫(yī)學(xué)方面展現(xiàn)出更廣闊的前景。

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