1.本發(fā)明涉及一株高利用低聚半乳糖的假小鏈雙歧桿菌及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域以及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

2.假小鏈雙歧桿菌是健康成年人腸道菌群中常見的雙歧桿菌之一。研究發(fā)現(xiàn)，假小鏈雙歧桿菌無論對慢性、低度、全身性的炎癥小鼠還是急性、局部的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的疾病活動指數(shù)和炎癥反應(yīng)均有改善效果，此外，還能夠產(chǎn)生或轉(zhuǎn)化葉酸、共軛亞油酸、共軛亞麻酸等多種具有生物活性的物質(zhì)。假小鏈雙歧桿菌可能具有較強的抗炎功能，作為潛能益生菌具有廣闊的應(yīng)用前景。
3.但是，研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的產(chǎn)生或者年齡的增長，體內(nèi)的益生菌的含量逐漸降低，如何增加益生菌在體內(nèi)的定殖，成為近年來的研究方向。
4.施用益生元是調(diào)節(jié)腸道菌群組成和代謝活性的策略之一。益生元被定義為“部分/全部不被宿主消化吸收，可使胃腸道微生物區(qū)系的組成和/或活性發(fā)生特定變化，從而為宿主的健康帶來益處”。在商業(yè)上廣泛應(yīng)用的益生元包括菊粉、低聚果糖和低聚半乳糖等。臨床實驗表明，益生元(尤其是低聚半乳糖)可以促進嬰兒和成人腸道中雙歧桿菌的生長，使糞便樣品中的雙歧桿菌數(shù)量增加了2至3個對數(shù)。
5.研究發(fā)現(xiàn)，益生元能促進胃腸道中益生菌，如嬰兒雙歧桿菌、瑞士乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、短雙歧桿菌的存活；并且，益生元能減輕胃腸道中乳鐵蛋白對益生菌存活的抑制作用，益生元能保護乳鐵蛋白益生菌免受胃酸和膽鹽的消化，提高益生菌存活率(記載于申請?zhí)枮?020109770159的中國發(fā)明專利申請文本中)；然而，不同種腸道菌甚至同種不同株腸道菌對低聚半乳糖的利用情況也存在差異；例如，申請?zhí)枮?01010613330x的中國發(fā)明專利文本中公開了一種可快速增加乳制品中阪崎腸桿菌的數(shù)量的快速增殖劑，該增殖劑中包含了低聚葡萄糖、低聚半乳糖或低聚果糖。
6.又如，申請?zhí)枮?020112240849的中國發(fā)明專利申請文本中公開了包含低聚半乳糖的保護劑可提高嗜酸乳桿菌的凍干活性。
7.以上均證明了益生元，比如低聚半乳糖能夠增加益生菌在體外的增殖能力，但是，有報道表明，在補充益生元的條件下并不能夠增加益生菌其在體內(nèi)的定殖能力，例如，文獻(alander et al.2001:effect of galacto
?
oligosaccharide supplementation on human faecal microflora and on survival and persistence of bifidobacterium lactis bb
?
12 in the gastrointestinal tract)公開了：補充低聚半乳糖并不能增強動物雙歧桿菌乳亞種bb
?
12在腸道中的存活或持久性。
8.因此，提供一種能夠使其在腸道內(nèi)定殖的假小鏈雙歧桿菌并提高其在體內(nèi)的定殖能力成為研究的熱點和難點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

9.[技術(shù)問題]
[0010]
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一株對低聚半乳糖利用能力強的且能在體內(nèi)定殖的假小鏈雙歧桿菌菌株(bifidobacterium pseudocatenulatum)及其應(yīng)用。
[0011]
[技術(shù)方案]
[0012]
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一株假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170，所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc no:61548，保藏日期為2021年03月09日。
[0013]
所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170，是來源于江蘇省無錫市的健康成年人的糞便樣品，該菌株經(jīng)測序分析，將測序得到的序列在ncbi standard nucleotide blast中進行核酸序列比對，結(jié)果顯示與雙歧桿菌屬假小鏈雙歧桿菌種的核酸序列相似度為100％；結(jié)果顯示菌株為假小鏈雙歧桿菌，將其命名為假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170。
[0014]
所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170在添加了0.05％半胱氨酸的mrs固體培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色圓形凸起，表面光滑、半透明狀，直徑為1～2mm(如圖1所示)；
[0015]
在本發(fā)明的一種實施方式中，施用低聚半乳糖后，原宿主腸道中的假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的相對豐度可顯著提高。
[0016]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170在體外以低聚半乳糖為碳源的ycfa液體培養(yǎng)基中，其生長速率顯著提高、代時顯著縮短。
[0017]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170在與低聚半乳糖為組合的應(yīng)用中，其在小鼠腸道中的定殖強度和持久性顯著提高。
[0018]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170在單獨施用時，提高了小鼠腸道中的異戊酸和戊酸含量，戊酸會抑制破骨細胞樣細胞的成熟，促進成骨細胞的成熟和成骨細胞的胞外基質(zhì)礦化，戊酸還能抑制nf
?
κb p65蛋白的產(chǎn)生(促炎癥)和增強il
?
10mrna的表達(抗炎)。
[0019]
所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170在與低聚半乳糖為組合的應(yīng)用中，提高了小鼠腸道中的乙酸、丙酸和總短鏈脂肪酸含量，短鏈脂肪酸對于改善腸道菌群失調(diào)、維持腸上皮細胞的形態(tài)和提高腸道的生理功能等具有重要作用。
[0020]
本發(fā)明還提供了一種含有上述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的微生物制劑。
[0021]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物制劑中，所述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的活菌數(shù)為不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g。
[0022]
本發(fā)明還提供了一種改善宿主腸道健康的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品中含有上述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170或上述微生物制劑。
[0023]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述產(chǎn)品中還含有低聚半乳糖。
[0024]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述產(chǎn)品中，假小鏈雙歧桿菌的活菌數(shù)不低于1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g。
[0025]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述產(chǎn)品包含食品或藥品。
[0026]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述食品為保健食品。
[0027]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述食品為使用上述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170，或上述微生物制劑的發(fā)酵劑生產(chǎn)得到的乳制品、豆制品或果蔬制品。
[0028]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述食品為含有上述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170，或上述微生物制劑的飲料或零食。本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵劑的制備方法為將上述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170按照占培養(yǎng)基總質(zhì)量2～4％的接種量接種到培養(yǎng)基中，于37℃下厭氧培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，得到菌體；將菌體用生理鹽水清洗3次后用凍干保護劑重懸，得到重懸液；將重懸液采用真空冷凍法進行凍干，得到發(fā)酵劑。
[0029]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述凍干保護劑和菌體的質(zhì)量比為2:1。
[0030]
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述凍干保護劑包含130g/l的脫脂奶粉。
[0031]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述培養(yǎng)基的ph為6.8。
[0032]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥品含有上述假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170、藥物載體和/或藥用輔料。
[0033]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物載體包含微囊、微球、納米粒和/或脂質(zhì)體。
[0034]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥用輔料包含賦形劑和/或附加劑。
[0035]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述賦形劑包含黏合劑、填充劑、崩解劑和/或潤滑劑。
[0036]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述附加劑包含增溶劑、助溶劑、潛溶劑和/或防腐劑。
[0037]
本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥品的劑型為粉劑、顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。
[0038]
本發(fā)明還提供了上述產(chǎn)品在提高假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的腸道定殖能力中的應(yīng)用。
[0039]
有益效果
[0040]
本發(fā)明提供了一株假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170，此假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170具有高效利用低聚半乳糖的能力并且可在腸道內(nèi)高效定殖，具體體現(xiàn)在：
[0041]
(1)當采用低聚半乳糖(10克/天，4周)干預(yù)后，人腸道原有的假小鏈雙歧桿菌的相對豐度出現(xiàn)不同程度的變化，其中，本發(fā)明的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170對低聚半乳糖具有高響應(yīng)，它在原宿主腸道中的相對豐度顯著提高。
[0042]
(2)采用本發(fā)明的方法，從人糞便樣品獲得的包括假小鏈雙歧桿菌ccfm1170在內(nèi)的4個假小鏈雙歧桿菌分離株及對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046這5株假小鏈雙歧桿菌菌株，在體外以低聚半乳糖作為碳源的ycfa液體培養(yǎng)基中，生長特性表現(xiàn)不同，本發(fā)明的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170生長速率最快，代時最短。
[0043]
(3)益生菌定殖于腸道中是其發(fā)揮益生功能的基礎(chǔ)。在給予小鼠本發(fā)明的假小鏈
雙歧桿菌ccfm1170和低聚半乳糖組合4周后，與單給予假小鏈雙歧桿菌ccfm1170相比，小鼠糞便中假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的數(shù)量顯著提高，兩周洗脫期中，持續(xù)給予低聚半乳糖后，假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的定殖持久性也顯著提高。
[0044]
(4)假小鏈雙歧桿菌是雙歧桿菌的一種，研究發(fā)現(xiàn)假小鏈雙歧桿菌具有較強的抗炎功能，還能夠產(chǎn)生或轉(zhuǎn)化葉酸、共軛亞油酸、共軛亞麻酸等多種具有生物活性的物質(zhì)。給予小鼠本發(fā)明的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170，小鼠腸道中的異戊酸和戊酸含量顯著提高；戊酸會抑制破骨細胞樣細胞的成熟，促進成骨細胞的成熟和成骨細胞的胞外基質(zhì)礦化，戊酸還能抑制nf
?
κb p65蛋白的產(chǎn)生(促炎癥)和增強il
?
10mrna的表達(抗炎)。而給予小鼠本發(fā)明的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170和低聚半乳糖組合4周后，小鼠腸道中乙酸、丙酸以及總短鏈脂肪酸含量顯著提高，短鏈脂肪酸有助于改善腸道菌群和穩(wěn)定腸道功能。
[0045]
因此，本發(fā)明的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170在制備具有高定殖能力的改善宿主健康的產(chǎn)品(如食品、藥品或保健品等)中，具有巨大的應(yīng)用前景。
[0046]
生物材料保藏
[0047]
一株假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170，分類學命名為bifidobacterium pseudocatenulatum，已于2021年03月09日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc no:61548，保藏地址為廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所。
附圖說明
[0048]
圖1：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170在添加了0.05％半胱氨酸的mrs固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征。
[0049]
圖2：低聚半乳糖干預(yù)4周，人腸道中，假小鏈雙歧桿菌占腸道菌群的相對豐度的變化。
[0050]
圖3：低聚半乳糖作為碳源的ycfa液體培養(yǎng)基中，5株假小鏈雙歧桿菌菌株的生長狀況。假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170(來源于圖2中1號樣品)，假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx3m3(來源于圖2中3號樣品)，假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx9m6(來源于圖2中9號樣品)，假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx16m1(來源于圖2中16號樣品)；其中(a)生長曲線圖，(b)代時；不同字母“a，b，c”表示假小鏈雙歧桿菌菌株的代時長短具有顯著性差異(p<0.05)。
[0051]
圖4：動物實驗的分組及處理方法，其中，符號“/”表示不做任何處理。
[0052]
圖5：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170和陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1046在balb/c小鼠腸道中的定殖能力(包括干預(yù)4周時的定殖強度和后續(xù)洗脫2周過程中的定殖持久性)；
[0053]
其中，(a)假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的定殖強度；不同字母“a，b，c，d”表示不同組別小鼠糞便中假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的數(shù)量具有顯著性差異(p<0.05)；
[0054]
(b)陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1046的定殖強度；不同字母“a，b，c”表示不同組別小鼠糞便中假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1046的數(shù)量具有顯著性差異(p<0.05)；
[0055]
(c)假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的定殖持久性；其中，“**”、“***”表示洗脫期時，與不添加低聚半乳糖的實驗組相比，持續(xù)給予低聚半乳糖的實驗組小鼠糞便中假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的數(shù)量具有顯著性差異，分別為(p<0.01)和(p<0.001)，“ns”表示無顯著性差異(p>0.05)；
[0056]
(d)陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1046的定殖持久性；其中，“**”、“***”表示洗脫期時，與不添加低聚半乳糖的實驗組相比，持續(xù)給予低聚半乳糖的實驗組小鼠糞便中假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1046的數(shù)量具有顯著性差異，分別為(p<0.01)和(p<0.001)，“ns”表示無顯著性差異(p>0.05)。
具體實施方式
[0057]
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步的闡述。
[0058]
下述實施例中涉及的低聚半乳糖購自云浮市新金山生物科技有限公司。下述實施例中所涉及的假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx3m3，假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx9m6，假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx16m1均為同期篩選得到的菌株，保藏于江南大學食品學院生物技術(shù)中心自有菌種庫中，并且這三株菌的全基因組測序數(shù)據(jù)已在ncbi的sra數(shù)據(jù)庫中公開。
[0059]
下述實施例中所涉及的陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc no.60599。
[0060]
下述實施例中涉及的培養(yǎng)基如下：
[0061]
mmrs液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，葡萄糖20g/l，無水乙酸鈉2g/l，酵母提取物5g/l，檸檬酸氫二銨2g/l，k2po4·
3h2o 2.6g/l，mgso4·
7 h2o 0.5g/l，mnso4·
h2o 0.25g/l，吐溫80 1ml/l，l
?
半胱氨酸0.5g/l；ph為6.8。
[0062]
mmrs固體培養(yǎng)基：在mmrs(含l
?
半胱氨酸的mrs)液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂20g/l。
[0063]
ycfa液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/l，葡萄糖10g/l，酵母提取物2.5g/l，磷酸氫二鉀0.45g/l，磷酸二氫鉀0.45g/l，氯化鈉0.9g/l，mgso4·
7 h2o 0.09g/l，氯化鈣0.09g/l，血紅素0.05g/l，l
?
半胱氨酸1g/l，刃天青1mg/l，生物素10μg/l，鈷胺素10μg/l，對氨基苯甲酸30μg/l，葉酸50μg/l，吡哆胺150μg/l，硫胺素0.05mg/l，核黃素0.05mg/l，維生素k
1 10mg/l，用碳酸氫鈉調(diào)ph至6.8。
[0064]
下述實施例中涉及的檢測方法如下：
[0065]
活菌數(shù)的檢測方法：采用國標《gb 4789.35
?
2016食品安全國家標準食品微生物學檢測乳酸菌檢測》。
[0066]
下述實施例中涉及的假小鏈雙歧桿菌菌體的制備方法如下：
[0067]
將假小鏈雙歧桿菌劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧條件下培養(yǎng)48h，得到單菌落；挑取單菌落接種于5ml mmrs液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液；將活化液按2％(v/v)的接種量接種于mmrs液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下培養(yǎng)18h，得到菌液；將菌液經(jīng)5000r/min離心15min，棄去上層培養(yǎng)基，得到假小鏈雙歧桿菌菌體。
[0068]
下述實施例中涉及的糞便中假小鏈雙歧桿菌絕對定量方法如下：
[0069]
假小鏈雙歧桿菌活化三代后進行菌落活菌計數(shù)，同時取1ml菌懸液按照細菌基因組dna提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)的說明書提取純菌dna。小鼠糞便細菌基因組dna使用糞便基因組提取試劑盒(購自美國mp公司)提取，按試劑盒說明進行操作。實驗通過qpcr(實時熒光定量pcr)法測定，以循環(huán)閾值(cycle threshold,ct)和不同稀釋梯度的純菌菌落形成單位對數(shù)值(log cfu)建立標準曲線進行定量。
[0070]
本發(fā)明提供的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170和陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046的qpcr引物均參考過往文獻(具體公開于youn et al.2008:evaluation of the pcr method for identification of bifidobacterium species；junick et al.2012:quantification of human fecal bifidobacterium species by use of quantitative real
?
time pcr analysis targeting the groel gene.論文當中)設(shè)計，并由上海生工進行合成，驗證引物特異性后進行實驗。
[0071]
最終假小鏈雙歧桿菌ccfm1170選擇的引物：上游為g020f：gacagccgtagagatat，下游引物為im3r：cggggtgctgcccactttcatg；陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046選擇的引物：上游為b_pcat
?
f：agccatcgtcaaggagcttatcgcag，下游引物為b_pcat
?
r：cacgacgtcctgctgagagctcac。
[0072]
實施例1：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的篩選、菌種鑒定及培養(yǎng)
[0073]
具體步驟如下：
[0074]
一、低聚半乳糖干預(yù)后，人腸道中假小鏈雙歧桿菌菌株的差異響應(yīng)
[0075]
招募10名(1)近1年內(nèi)沒有進行腹部或腸道手術(shù)(2)近2個月內(nèi)沒有使用抗生素(局部用藥除外)(3)近1個月內(nèi)沒有食用益生菌/益生元/合生元等補充劑的健康成年人，每天服用10克低聚半乳糖，為期4周。分別于實驗開始前的基線期、低聚半乳糖干預(yù)2周、低聚半乳糖干預(yù)4周收集糞便樣品，立即置于
?
80℃冰箱保存直至提取糞便dna實驗之前。1名志愿者實驗期內(nèi)使用了抗生素，1名志愿者在干預(yù)期未按規(guī)定時間采集糞便樣品，其余8名志愿者完成低聚半乳糖干預(yù)實驗，這8名志愿者的糞便樣品用于后續(xù)實驗及分析。
[0076]
通過糞便基因組提取試劑盒(購自美國mp公司)提取糞便中細菌dna，用細菌特異性引物擴增細菌16s rdna的v3～v4區(qū)，上游引物為：cctaygggrbgcascag，下游引物為：ggactacnngggtatctaat，此外，用雙歧桿菌種特異性引物bif
?
groel pcr擴增雙歧桿菌groel基因，上游為bif
?
groel
?
f：tccgattacgaycgygagaagct，下游引物為bif
?
groel
?
r：csgcytcggtsgtcaggaacag。
[0077]
產(chǎn)物分別使用qiaquick gel extraction kit試劑盒根據(jù)說明書進行膠回收，使用qubittm dsdna br assay kit定量，根據(jù)truseq dna lt sample preparation kit的說明進行文庫的構(gòu)建，最后使用miseq v3 reagent kit(600cycles
?
pe)在illumina miseq上進行上機測序。測序完成后，進行下機數(shù)據(jù)處理并將數(shù)據(jù)可視化。
[0078]
低聚半乳糖干預(yù)后，人腸道假小鏈雙歧桿菌占腸道菌群的相對豐度(由細菌16s rdna的v3～v4區(qū)擴增及測序分析可得雙歧桿菌屬占腸道菌群的相對豐度，由雙歧桿菌groel基因擴增及測序分析可得假小鏈雙歧桿菌種占雙歧桿菌屬的相對豐度，兩者相乘即為假小鏈雙歧桿菌占腸道菌群的相對豐度，例如：某志愿者雙歧桿菌屬占腸道菌群30％，假
小鏈雙歧桿菌又占雙歧桿菌屬的30％，那么該受試者的假小鏈雙歧桿菌占腸道菌群的9％的變化見圖2。
[0079]
由圖2可知，不同人腸道中的假小鏈雙歧桿菌對低聚半乳糖的響應(yīng)差異非常大，有些個體體內(nèi)的假小鏈雙歧桿菌完全沒有被刺激生長(例如2號、9號和10號個體)，其他個體體內(nèi)的假小鏈雙歧桿菌被不同程度地刺激生長(例如1號、3號和16號個體)，其中，1號個體體內(nèi)的假小鏈雙歧桿菌被刺激生長的程度最大，具體表現(xiàn)為1號個體體內(nèi)的假小鏈雙歧桿菌的相對豐度在低聚半乳糖干預(yù)后具有最大增加量。此結(jié)果表明，1號個體體內(nèi)的假小鏈雙歧桿菌對低聚半乳糖的干預(yù)具有高響應(yīng)特性。
[0080]
上述提取糞便中細菌dna需用1g左右糞便樣品，剩余的糞便樣品用于后續(xù)假小鏈雙歧桿菌的分離篩選實驗。
[0081]
二、假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的獲得
[0082]
1、篩選
[0083]
將步驟一得到的樣本，混勻樣本，吸取0.5ml樣本加到4.5ml滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，然后分別取100μl稀釋梯度為10
?4、10
?5、10
?6的稀釋液于ph＝6.8添加了莫匹羅星的mmrs固體培養(yǎng)基上進行平板涂布，37℃厭氧培養(yǎng)48h，觀察并記錄菌落形態(tài)；
[0084]
挑取mmrs固體培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落進行劃線分離，經(jīng)37℃厭氧培養(yǎng)48h后，再次挑取mmrs固體培養(yǎng)基上不同形態(tài)的單菌落進行劃線分離，直至得到形態(tài)一致的純的單菌落；
[0085]
挑取mmrs固體培養(yǎng)基上的純菌落接種于5ml mmrs液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18h；取1ml菌液于無菌離心管中，5000r/min離心15min后棄去上層培養(yǎng)基，菌泥重懸于30％甘油溶液中置于
?
80℃中保藏，得到菌株。
[0086]
2、鑒定
[0087]
分別對分離得到的菌株菌體進行pcr擴增16s rdna，pcr產(chǎn)物送至金唯智(蘇州)生物科技有限公司進行測序，將測序得到的結(jié)果在ncbi standard nucleotide blast中進行核酸序列比對，比對結(jié)果為假小鏈雙歧桿菌，命名為假小鏈雙歧桿菌ccfm1170。
[0088]
同期篩選得到了3株菌株，分別命名為：假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx3m3，假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx9m6，假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx16m1。
[0089]
3、培養(yǎng)
[0090]
分別將上述假小鏈雙歧桿菌接入mmrs固體培養(yǎng)基上于37℃厭氧培養(yǎng)48h后，觀察其菌落。發(fā)現(xiàn)其菌落呈乳白色圓形凸起，表面光滑、半透明狀，直徑為1～2mm。培養(yǎng)前后通過ph計測量空白培養(yǎng)液以及加菌的培養(yǎng)液的ph，發(fā)現(xiàn)假小鏈雙歧桿菌在培養(yǎng)過程中產(chǎn)酸。將假小鏈雙歧桿菌菌株接入mmrs液體培養(yǎng)基中，置于酶標儀中，37℃下厭氧培養(yǎng)48h，培養(yǎng)過程中，間隔1小時測量培養(yǎng)液的od
600
，發(fā)現(xiàn)假小鏈雙歧桿菌培養(yǎng)18～24h達到生長穩(wěn)定期。
[0091]
實施例2：低聚半乳糖作為碳源的ycfa液體培養(yǎng)基中，假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的生長特性
[0092]
具體步驟如下：
[0093]
(1)分別將假小鏈雙歧桿菌ccfm1170、假小鏈雙歧桿菌ccfm1046、假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx3m3、假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx9m6、假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx16m1劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48h，得到單菌落；
[0094]
挑取單菌落接種于mrs液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液。
[0095]
(2)分別取1ml活化液于無菌離心管中，5000r/min離心15min后棄去上層培養(yǎng)基得到菌泥，再用1ml無菌生理鹽水重懸菌泥，再以2％(v/v)的接種量接種于低聚半乳糖取代葡萄糖的ycfa液體培養(yǎng)基中(腸道微生物體外模擬培養(yǎng)方法)，置于酶標儀中，37℃下厭氧培養(yǎng)48h，培養(yǎng)過程中，間隔1小時測量培養(yǎng)液的od
600
。
[0096]
結(jié)果顯示：5株假小鏈雙歧桿菌的生長曲線如圖3(a)所示；5株假小鏈雙歧桿菌的代時如圖3(b)所示；其中，代時指細胞每分裂一次所需的時間；代時越短，表明生長速度越快；各菌株在對數(shù)期的代時大小可以反映其生長速率的快慢，對數(shù)期代時公式如下所示：代時＝(t2?
t1)/3.322(od2?
od1)；式中，t2為對數(shù)生長末期的時間，t1為剛進入對數(shù)生長期的時間，od2、od1為在t2、t1時刻測得的菌懸液的吸光值。
[0097]
由圖3(a)可知，假小鏈雙歧桿菌ccfm1170在對數(shù)生長期生長速率較快，且到達生長穩(wěn)定期時擁有最大生長量，為od
600
為0.94
±
0.01，而假小鏈雙歧桿菌ccfm1046、假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx3m3、假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx9m6、假小鏈雙歧桿菌fjswxjndx16m1在穩(wěn)定期時的od
600
分別為0.52
±
0.02、0.71
±
0.01、0.77
±
0.03、0.85
±
0.03；此結(jié)果表明，假小鏈雙歧桿菌ccfm1170具有較強的低聚半乳糖利用能力，對低聚半乳糖作為碳源的ycfa培養(yǎng)基環(huán)境適應(yīng)能力最強。而假小鏈雙歧桿菌ccfm1046生長速率最慢，到達生長穩(wěn)定期時的生長量也最小。
[0098]
此外，由圖3(b)可知，相比較而言，假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的代時較短，即細菌繁殖一代所需的時間較短，此結(jié)果也表明，假小鏈雙歧桿菌ccfm1170具有較強的低聚半乳糖利用能力，利用低聚半乳糖用于自身的生長繁殖，生長速率更快，代時更短。而假小鏈雙歧桿菌ccfm1046代時最長，說明它利用低聚半乳糖能力最差。以假小鏈雙歧桿菌ccfm1046作為陰性對照菌株，進行后續(xù)動物實驗。
[0099]
實施例3：低聚半乳糖對假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170定殖能力的影響
[0100]
具體步驟如下：
[0101]
將假小鏈雙歧桿菌ccfm1170、陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046分別接入mmrs液體培養(yǎng)基中于37℃厭氧培養(yǎng)36h后，5000r/min，15min，4℃離心收集菌泥，經(jīng)生理鹽水洗滌后重懸于生理鹽水中，菌濃度為5
×
109cfu/ml，獲得菌懸液，菌液每日現(xiàn)配現(xiàn)用。低聚半乳糖的給予劑量為0.4克/天/只小鼠，根據(jù)小鼠的平均每日飲水量溶于飲用水中，每隔5天換一次飲用水。
[0102]
將體重為20
?
22g的spf級balb/c雄性小鼠64只，隨機分為8組，每組8只，分別為：(1)control組：空白對照；(2)gos組：干預(yù)期給予低聚半乳糖；(3)ccfm1170組：干預(yù)期灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌懸液；(4)gos+ccfm1170組：干預(yù)期給予低聚半乳糖且灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌懸液；(5)gos+ccfm1170+gos(洗脫期)組：干預(yù)期給予低聚半乳糖且灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌懸液，而洗脫期2周繼續(xù)給予低聚半乳糖；(6)ccfm1046組：干預(yù)期灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1046菌懸液；(7)gos+ccfm1046組：干預(yù)期給予低聚半乳糖且灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1046菌懸液；(8)gos+ccfm1046+gos(洗脫期)組：干預(yù)期給予低聚半乳糖且灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1046菌懸液，而洗脫期2周繼續(xù)給予低聚半乳糖。
[0103]
實驗共7周：第1周為小鼠適應(yīng)期，適應(yīng)期不做任何處理，小鼠自由飲食飲水；第2周至第5周為干預(yù)期：
[0104]
ccfm1170組、gos+ccfm1170組、gos+ccfm1170+gos(洗脫期)組每只小鼠每天灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌懸液200μl；ccfm1046組、gos+ccfm1046組、gos+ccfm1046+gos(洗脫期)組每只小鼠每天灌胃假小鏈雙歧桿菌ccfm1046菌懸液200μl；control組和gos組小鼠灌胃同等劑量的生理鹽水，同時gos組、gos+ccfm1170組、gos+ccfm1170+gos(洗脫期)組、gos+ccfm1046組、gos+ccfm1046+gos(洗脫期)組的飲用水中添加低聚半乳糖；第6周至第7周為洗脫期，所有組小鼠停止灌胃生理鹽水或假小鏈雙歧桿菌菌懸液，此外gos組、gos+ccfm1170組、gos+ccfm1046組的飲用水中也不再添加低聚半乳糖，僅有g(shù)os+ccfm1170+gos(洗脫期)組和gos+ccfm1046+gos(洗脫期)組的飲用水繼續(xù)添加低聚半乳糖。具體實驗分組及處理見圖4。
[0105]
在干預(yù)期末收集各個組小鼠的糞便，在洗脫1天、洗脫3天、洗脫7天、洗脫14天收集gos+ccfm1170組、gos+ccfm1170+gos(洗脫期)組、gos+ccfm1046組和gos+ccfm1046+gos(洗脫期)組小鼠的糞便。
[0106]
經(jīng)過灌胃進入小鼠腸道內(nèi)的菌株，如果沒有在腸道中定殖，則會因腸道蠕動隨糞便一起排出體外，通常認為24小時足夠?qū)⑽炊ㄖ车木昱懦鲶w外，之后再收集的糞便中的菌數(shù)即為腸道中定殖下來的菌株因新陳代謝脫落所致，可以用來表征腸道中該菌株的定殖量。因此，本實施案例對于小鼠糞便收集時間有一定要求，干預(yù)期末小鼠糞便收集時間點為距離前一天菌株灌胃過去24小時的時間點，洗脫1天即為該時間點累積24小時，洗脫3天、洗脫7天、洗脫14天以此類推。收集到的小鼠糞便進行qpcr絕對定量糞便中假小鏈雙歧桿菌ccfm1170或陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046的數(shù)量(結(jié)果如圖5所示)。
[0107]
結(jié)果顯示：干預(yù)末期，各組小鼠糞便中本發(fā)明提供的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的絕對數(shù)量如圖5(a)所示；干預(yù)末期，各組小鼠糞便中陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046的絕對數(shù)量如圖5(b)所示；洗脫期，gos+ccfm1170組和gos+ccfm1170+gos(洗脫期)組小鼠糞便中假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的絕對數(shù)量如圖5(c)所示；洗脫期，gos+ccfm1046組和gos+ccfm1046+gos(洗脫期)組小鼠糞便中陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046的絕對數(shù)量如圖5(d)所示。其中，control組小鼠糞便測得的假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的絕對菌數(shù)作為該菌qpcr法絕對定量菌數(shù)的檢出限；同理，control組小鼠糞便測得的假小鏈雙歧桿菌ccfm1046的絕對菌數(shù)作為假小鏈雙歧桿菌ccfm1046的qpcr法絕對定量菌數(shù)的檢出限。
[0108]
由圖5(a)可知，在低聚半乳糖的干預(yù)下，假小鏈雙歧桿菌ccfm1170在腸道中的定殖量顯著提高(10
7.09
±
0.18
cfu/g糞便)，與未加低聚半乳糖的ccfm1170組(10
5.55
±
0.40
cfu/g糞便)相比，提高大約兩個數(shù)量級(大約100倍)。
[0109]
由圖5(b)可知，低聚半乳糖的干預(yù)并未提高陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046在腸道中的定殖量，具體表現(xiàn)在gos+ccfm1046組(10
6.43
±
0.23
cfu/g糞便)與ccfm1046組(10
6.23
±
0.25
cfu/g糞便)相比，小鼠糞便中的絕對菌數(shù)無明顯差異(p>0.05)。
[0110]
由圖5(c)可知，低聚半乳糖提高了假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的定殖持久性，洗脫7天仍然穩(wěn)定定殖于gos+ccfm1170+gos(洗脫期)組小鼠的腸道中，洗脫14天仍然能從gos+ccfm1170+gos(洗脫期)組小鼠的糞便中檢測到，而洗脫期時未給予低聚半乳糖的gos+
ccfm1170組，洗脫3天定殖量就發(fā)生了明顯的下降。
[0111]
由圖5(d)可知，洗脫期繼續(xù)給予低聚半乳糖，陰性對照菌株假小鏈雙歧桿菌ccfm1046的定殖持久性并未提高，gos+ccfm1046組和gos+ccfm1046+gos(洗脫期)組小鼠糞便中的假小鏈雙歧桿菌ccfm1046都在洗脫1天后顯著降低，幾乎降低到了檢出限。
[0112]
可見，在腸道復雜環(huán)境中，本發(fā)明假小鏈雙歧桿菌ccfm1170能夠通過較強的低聚半乳糖的利用能力從而提高自身進入腸道時在腸道中競爭適應(yīng)性，定殖強度顯著提高，定殖持久性顯著延長。
[0113]
實施例4：低聚半乳糖對假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170代謝活性的影響
[0114]
具體實施方式同實施例3，在干預(yù)期末收集各個組小鼠的糞便，除了用于上述糞便中絕對菌數(shù)的測定，剩余糞便還用于短鏈脂肪酸種類及含量的測定，以表征菌株的代謝活性。
[0115]
具體步驟如下：
[0116]
稱取3顆左右小鼠糞便凍干(記錄凍干的糞便質(zhì)量)；加入500μl飽和nacl溶液并均質(zhì)；加入40μl 10％的硫酸酸化；然后加入1ml乙醚萃取樣品中的短鏈脂肪酸，振蕩30s后離心(12000rpm，15min，4℃)；吸取上清液加入0.25g無水硫酸鈉除去水分；靜置15min，以相同條件再次離心，取上層乙醚相加入進樣瓶中，上機分析。
[0117]
gc
?
ms條件為：rtx
?
wax毛細管色譜柱(30m
×
0.25μm
×
0.25μm)；載氣為氦氣，流速為2ml/min，分流比為10:1，進樣量為1μl；進樣溫度為240℃，按如下程序進行升溫：起始溫度為100℃，按7.5℃/min升溫至140℃，然后按60℃/min升溫至200℃，保持3min，離子化溫度為220℃；分析采用全掃描模式，采樣外標法計算各短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸)的濃度(μmol/g)；結(jié)果如表1所示：
[0118]
表1：4周干預(yù)結(jié)束時，小鼠糞便中短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸)以及總短鏈脂肪酸含量，數(shù)據(jù)表示為平均值
±
標準差?！?”表示與control組相比，該實驗組小鼠糞便中該項短鏈脂肪酸含量具有顯著差異(p<0.05)。
[0119][0120]
干預(yù)期末，各組小鼠糞便中短鏈脂肪酸的種類及含量如表1所示。由表1可知，與control組相比，ccfm1170組小鼠糞便的異戊酸、戊酸含量顯著提高，戊酸會抑制破骨細胞樣細胞的成熟，促進成骨細胞的成熟和成骨細胞的胞外基質(zhì)礦化，戊酸還能抑制nf
?
κb p65蛋白的產(chǎn)生(促炎癥)和增強il
?
10mrna的表達(抗炎)。
[0121]
與control組相比，gos+ccfm1170組小鼠糞便的乙酸、丙酸以及總短鏈脂肪酸含量顯著提高。乙酸是雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的最常見的短鏈脂肪酸之一，說明低聚半乳糖提高假小鏈雙歧桿菌ccfm1170定殖強度的同時提高了假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的代謝活性；丙酸是由其他腸道菌群產(chǎn)生的，說明假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的定殖調(diào)節(jié)了整體腸道菌群；總短鏈脂肪酸含量的顯著提高有利于維持腸上皮細胞形態(tài)和腸道功能，還有益于宿主血糖調(diào)節(jié)及胰島素敏感性的改善。
[0122]
可見，低聚半乳糖提高假小鏈雙歧桿菌ccfm1170定殖強度的同時提高了假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的代謝活性，促進宿主健康。
[0123]
實施例5：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的應(yīng)用假小鏈雙歧桿菌ccfm1170可用于制備菌粉，菌粉的具體制備過程如下：
[0124]
假小鏈雙歧桿菌ccfm1170劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48h，得到單菌落；挑取單菌落接種于mmrs液體培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液；將活化液按2％(v/v)的接種量接種于培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h，得到菌液；將菌液經(jīng)5000r/min離心15min，得到菌泥；將菌泥用生理鹽水清洗3次后用保護劑重懸至濃度為1
×
10
10
cfu/ml，得到菌懸液；將菌懸液在溫度37℃下孵育60min后凍干，得到假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉；
[0125]
其中，培養(yǎng)基的制備方法為：使用以培養(yǎng)基總重量計87.7％的水將10％酶水解脫脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨與0.3％酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其ph為6.8，得到培養(yǎng)基；
[0126]
保護劑的成分包含：130g/l脫脂奶粉。
[0127]
實施例6：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的應(yīng)用假小鏈雙歧桿菌ccfm1170可用于制備膠囊制品，膠囊制品的具體制備過程如下：
[0128]
假小鏈雙歧桿菌ccfm1170劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48h，得到單菌落；挑取單菌落接種于mrs液體培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液；將活化液按2％(v/v)的接種量接種于培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h，得到菌液；將菌液經(jīng)5000r/min離心15min，得到菌泥；將菌泥用生理鹽水清洗3次后用保護劑重懸至濃度為1
×
10
10
cfu/ml，得到菌懸液；菌懸液添加至濃度為30g/l的海藻酸鈉溶液中至濃度為2
×
109cfu/ml后，充分攪拌，使得假小鏈雙歧桿菌ccfm1170的細胞均勻地分散于海藻酸鈉溶液中，得到混合液；將混合液擠壓到濃度為20g/l的氯化鈣溶液中形成膠粒；待形成的膠粒靜止固化30min后，過濾收集膠粒；將收集得到的膠粒進行冷凍干燥48h，得到粉劑；將粉劑裝入到藥用膠囊中，得到膠囊制品；
[0129]
其中，培養(yǎng)基的制備方法為：使用以培養(yǎng)基總重量計87.7％的水將10％酶水解脫脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨與0.3％酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其ph為6.8，得到培養(yǎng)基。
[0130]
實施例7：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的應(yīng)用假小鏈雙歧桿菌ccfm1170可用于制備片劑，片劑的具體制備過程如下：
[0131]
假小鏈雙歧桿菌ccfm1170劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48h，得到單菌落；挑取單菌落接種于mrs液體培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液；將活化液按2％(v/v)的接種量接種于培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)
18h，得到菌液；將菌液經(jīng)5000r/min離心15min，得到菌泥；將菌泥用生理鹽水清洗3次后用保護劑重懸至濃度為1
×
10
10
cfu/ml，得到菌懸液；將菌懸液在溫度37℃下孵育60min后凍干，得到假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉；
[0132]
其中，培養(yǎng)基的制備方法為：使用以培養(yǎng)基總重量計87.7％的水將10％酶水解脫脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨與0.3％酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其ph為6.8，得到培養(yǎng)基；
[0133]
保護劑的成分包含：130g/l脫脂奶粉。
[0134]
稱取假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纖維素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉鈉12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份與水1.0重量份，得到原材料；將原材料混合，得到濕顆粒；將濕顆粒用中南制藥機械廠的壓片機進行壓片后使用青州市益康中藥機械有限公司的小型藥物干燥機進行干燥，得到片劑。
[0135]
實施例8：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的應(yīng)用假小鏈雙歧桿菌ccfm1170可用于制備發(fā)酵乳，發(fā)酵乳的具體制備過程如下：
[0136]
假小鏈雙歧桿菌ccfm1170劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48h，得到單菌落；挑取單菌落接種于mmrs液體培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液；將活化液按2％(v/v)的接種量接種于培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h，得到菌液；將菌液經(jīng)5000r/min離心15min，得到菌泥；將菌泥用生理鹽水清洗3次后用保護劑重懸至濃度為1
×
10
10
cfu/ml，得到菌懸液；將菌懸液在溫度37℃下孵育60min后凍干，得到假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉；
[0137]
其中，培養(yǎng)基的制備方法為：使用以培養(yǎng)基總重量計87.7％的水將10％酶水解脫脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨與0.3％酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其ph為6.8，得到培養(yǎng)基；
[0138]
保護劑的成分包含：130g/l脫脂奶粉。
[0139]
將假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉與商業(yè)干粉發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌和商業(yè)干粉發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌按照質(zhì)量比1:1:1的比例混合，得到發(fā)酵劑；將糖添加至鮮奶中至濃度為50g/l，得到混合液；將混合液在65℃、20mpa的條件下進行均質(zhì)后在95℃下保溫殺菌5min，得到發(fā)酵原料；將發(fā)酵原料降溫至35℃后以0.03％(v/v)的接種量將發(fā)酵劑接種至發(fā)酵原料中，于35℃下保溫發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳；將發(fā)酵乳于42℃下放置4h進行凝乳后，在4℃下冷藏24h進行后熟，得到發(fā)酵乳成品。
[0140]
實施例9：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的應(yīng)用假小鏈雙歧桿菌ccfm1170可用于制備果蔬飲料，果蔬飲料的具體制備過程如下：
[0141]
假小鏈雙歧桿菌ccfm1170劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48h，得到單菌落；挑取單菌落接種于mmrs液體培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液；將活化液按2％(v/v)的接種量接種于培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h，得到菌液；將菌液經(jīng)5000r/min離心15min，得到菌泥；將菌泥用生理鹽水清洗3次后用保護劑重懸至濃度為1
×
10
10
cfu/ml，得到菌懸液；將菌懸液在溫度37℃下孵育60min后凍干，得到假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉；
[0142]
其中，培養(yǎng)基的制備方法為：使用以培養(yǎng)基總重量計87.7％的水將10％酶水解脫脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨與0.3％酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其ph為6.8，得到培養(yǎng)
基；
[0143]
保護劑的成分包含：130g/l脫脂奶粉。
[0144]
將新鮮水果和蔬菜洗凈后榨汁，按照5g/l的比例加入食品級蛋白胨，在溫度140℃下高溫熱殺菌2秒；將殺菌后的果蔬汁降溫至約37℃后再添加本發(fā)明假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉，至濃度為不低于1
×
106cfu/ml，得到果蔬飲料，在4℃下冷藏保存。即可得到含有本發(fā)明假小鏈雙歧桿菌ccfm1170活菌的果蔬飲料。
[0145]
實施例10：假小鏈雙歧桿菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)ccfm1170的應(yīng)用
[0146]
假小鏈雙歧桿菌ccfm1170可用于制備乳飲品，乳飲品的具體制備過程如下：
[0147]
假小鏈雙歧桿菌ccfm1170劃線于mmrs固體培養(yǎng)基上，37℃條件下厭氧培養(yǎng)48h，得到單菌落；挑取單菌落接種于mmrs液體培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h進行活化，連續(xù)活化兩代，得到活化液；將活化液按2％(v/v)的接種量接種于培養(yǎng)基中，37℃條件下厭氧培養(yǎng)18h，得到菌液；將菌液經(jīng)5000r/min離心15min，得到菌泥；將菌泥用生理鹽水清洗3次后用保護劑重懸至濃度為1
×
10
10
cfu/ml，得到菌懸液；將菌懸液在溫度37℃下孵育60min后凍干，得到假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉；
[0148]
其中，培養(yǎng)基的制備方法為：使用以培養(yǎng)基總重量計87.7％的水將10％酶水解脫脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨與0.3％酵母浸膏溶解，然后調(diào)整其ph為6.8，得到培養(yǎng)基；
[0149]
保護劑的成分包含：130g/l脫脂奶粉。
[0150]
將脫脂奶在95℃殺菌20min后冷卻至4℃，得到原料；在原料中添加假小鏈雙歧桿菌ccfm1170菌粉至濃度為不低于1
×
106cfu/ml，得到乳飲品，在4℃下冷藏保存。
[0151]
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。

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網(wǎng)址: 一株高利用低聚半乳糖的假小鏈雙歧桿菌及其應(yīng)用 http://m.gysdgmq.cn/newsview780246.html